该技术已申请专利。仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。 制备冻干蛋白配制品的方法1.相关申请的交叉引用2.本技术要求2020年9月14日提交的美国临时专利申请号63/077,908的优先权权益，将其披露内容通过引用以其全文特此并入。
技术领域：
：3.本披露提供了用于制备冻干配制品的方法，这些配制品包含表现出改善的储存稳定性的蛋白质，如抗体或双特异性抗体构建体。4.通过引用并入5.通过引用整体并入的是与本文同时提交的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表，其鉴定如下：名为“55423_seqlisting.txt”的ascii(文本)文件，345,229字节，创建于2020年9月14日。
背景技术：
：：6.基于蛋白质的药物(如含有抗体、抗体片段以及双特异性抗体构建体的药物)对于治疗各种疾病和病症变得日益重要。然而，蛋白质仅临界稳定(marginallystable)并且极易受到化学和物理降解二者的影响。化学降解是指涉及共价键的修饰，如脱酰胺化、氧化、裂解、剪切/片段化、形成新的二硫桥键、水解、异构化或去糖基化。物理降解包括蛋白质去折叠、对表面的不希望的吸附、和聚集。处理这些物理和化学不稳定性是蛋白质药物开发中最具挑战性的任务之一(chi等人,pharmres[药物研究],第20卷，第9期,2003年9月,第1325-1336页,roberts,trendsbiotechnol.[生物技术趋势]2014年7月；32(7):372-80)。[0007]特别地，需要保护半衰期延长的抗体构建体(例如，包含半衰期延长模式的双特异性t细胞接合剂如fc分子)，以防止蛋白质聚集和/或其他降解事件。分子的蛋白质聚集是有问题的，因为它会损害治疗性蛋白的生物活性和质量(规格)。此外，由于从最终产物中去除聚集体所需的复杂的纯化步骤，分子的聚集可能降低了产物产率。最近，人们还越来越关注并且有越来越多的证据证明聚集蛋白(甚至是人源化或全人源蛋白质)的存在可以显著增加患者对活性蛋白质单体产生免疫应答的风险，导致形成中和抗体和抗药性，或其他不良副作用(mahlerjpharmsci.[药物科学杂志]2009年9月；98(9):2909-34)。[0008]通常将基于蛋白质的药物配制品冻干，并且以固态储存以帮助在储存过程中保持配制品中蛋白质(如抗体或双特异性抗体构建体)的完整性。然而，许多当前的冻干蛋白配制品的方法不能产生随时间变化表现出合适的稳定性的固态配制品。因此，需要新的方法，该方法产生表现出改善的储存稳定性的冻干蛋白配制品。技术实现要素：[0009]在一方面，本披露提供了制备冻干配制品的方法，该方法包括(a)冷却含有包含蛋白质、糖以及表面活性剂的液体配制品的冻干室至约-35℃至约-50℃的温度范围以产生冷冻配制品，并且将该室在约-40℃至约-50℃的温度范围下保持约2小时至约24小时的时间段；(b)加热该室至约-30℃至约-20℃的温度范围和约25毫托至约100毫托的压力范围以产生初次干燥配制品，并且将该室在约-30℃至约-20℃的温度范围下和约25毫托至约100毫托的压力范围下保持约45小时至约60小时的时间段；(c)加热该室至约20℃至约35℃的温度范围以产生二次干燥配制品，并且将该室在约20℃至约30℃的温度范围下和约25毫托至约100毫托的压力范围下保持约5小时至约10小时的时间段，以产生该冻干配制品；其中该液体配制品具有约3-7的ph，并且不含有甘露糖醇；并且该方法缺少退火步骤。[0010]在另一方面，本披露提供了通过本披露的方法制备的冻干蛋白配制品。[0011]通过阅读以下详细说明，其他方面和优点对于本领域普通技术人员将显而易见。尽管本文披露的方法易于应用于各种形式的实施例，但在理解本披露为说明性的而不旨在将本发明限于本文所述的特定实施例的情况下，以下描述包括特定实施例。附图说明[0012]图1示出了通过rce-sds测量的含有1mg/ml双特异性抗体构建体的液体配制品和重构冻干配制品(其用退火步骤制备)在25℃下储存1个月后的剪切水平的比较，这些双特异性抗体构建体分别包含以下列出的序列：seqidno:22(bitea)、seqidno:77(biteb)、seqidno:87(bitec)、和seqidno:97(bited)。该重构冻干配制品在加速应力条件下没有示出剪切损失的显著增加。[0013]图2示出了通过rce-sds测量的1mg/mlbiteb的液体和重构冻干配制品(其用退火步骤制备)在40℃下储存1个月后的剪切水平的比较。[0014]图3示出了通过se-uhplc测量的含有不同蛋白质浓度的biteb的重构冻干配制品(其用退火步骤制备)在40℃下储存1个月后的高分子量(hmw)物质百分比。在加速应力条件下，％hmw没有增加，证明了冻干周期对高浓度蛋白配制品(如高浓度抗体或双特异性抗体构建体配制品)的适用性。[0015]图4示出了将含有23mg/ml的biteb的冻干配制品储存在冻干周期期间蛋白质经历的冷冻温度下后，通过se-uhplc测量的％hmw的增加。将“退火”样品在-45℃下储存48小时，然后在-12℃下储存5小时，在-45℃下储存5小时并且在-25℃下储存48小时。将“非退火”样品在-45℃下储存58小时，然后在-25℃下储存48小时。[0016]图5示出了具有-10℃的干燥温度的安慰剂配制品(含有10mm谷氨酸、9％(w/v)蔗糖和0.01％(w/v)聚山梨醇酯80)的冻干周期(不使用退火步骤)，其不诱导饼塌陷。饼完整性是可接受的。在饼中观察到一定的弯曲度。具体实施方式[0017]本文披露了制备冻干配制品的方法，这些配制品包含表现出改善的稳定性的蛋白质，如抗体或双特异性抗体构建体(例如，半衰期延长的双特异性抗体构建体)。本披露的冻干方法有利地导致降低的物理降解(如聚集)，以及降低的化学降解(如降低的剪切和脱酰胺化)。此外，本文披露的冻干方法能够稳定低浓度和高浓度蛋白配制品，如含有抗体和双特异性抗体构建体的配制品。[0018]定义[0019]如本文所用，术语“药物配制品”涉及适于向有需要的受试者施用的配制品。术语“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”在本文中可互换地使用，是指任何希望施用本披露的药物配制品的受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人、非人灵长类动物、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、母牛等，优选人。本披露的药物配制品是稳定的和药学上可接受的，即能够引发所希望的治疗效果，而不会在施用药物配制品的受试者中引起显著不希望的局部或全身性作用。本披露的药学上可接受的配制品可以是无菌的。具体地，术语“药学上可接受的”可以意指由管理机构或其他受普遍承认的药典批准在动物中使用，并且更特别地在人中使用，但不限于由管理机构批准的那些。[0020]术语“稳定性”或“稳定化”涉及药物配制品的整体稳定性，并且特别地涉及活性成分(例如，蛋白质，如双特异性抗体构建体)本身的稳定性，特别是在配制、填充、运输、储存以及施用期间。“稳定的配制品”是其中的蛋白质(例如，抗体或双特异性抗体构建体)在储存后和加工过程(例如冷冻/解冻、机械混合和冻干)中基本上保持其物理和/或化学完整性和生物活性的配制品。蛋白质稳定性可以通过形成高分子量(hmw)物质、失去酶活性、产生肽片段以及改变电荷特征来测量，如在下文冻干蛋白配制品的稳定性部分中所描述的。[0021]如本文所用，术语“聚集”是指分子之间的直接相互吸引，例如经由范德华力或化学键合。特别地，聚集被理解为蛋白质积聚和凝聚在一起。聚集体可包括无定形聚集体、寡聚体，并且典型地称为高分子量(hmw)物质，即，具有比非聚集分子的产物分子更高分子量的分子。[0022]本文使用的术语“(蛋白质)聚集体”通常涵盖较高分子量的蛋白质物质，如“寡聚体”或“多聚体”，而不是所希望的确定物质(例如单体)。该术语在本文中可与术语“高分子量”物质和“hmw”互换地使用。蛋白质聚集体的大小(从小(二聚体)到大组件(亚可见或甚至可见颗粒)以及直径范围从纳米到微米)、形态(近似球状到针状)、蛋白质结构(天然相比于非天然/变性)、分子间键合的类型(共价相比于非共价)、可逆性和溶解性通常不同。可溶性聚集体覆盖约1至100nm的大小范围，并且蛋白质颗粒覆盖亚可见(约0.1-100nm)和可见(》100nm)范围。所有上述类型的蛋白质聚集体通常涵盖在该术语中。因此，术语“(蛋白质)聚集体”是指两种或更多种蛋白质单体的所有种类物理缔合或化学连接的非天然种类。[0023]如本文所用，术语“低分子量(lmw)”物质是指蛋白质(如双特异性抗体构建体)的片段。[0024]方法[0025]本披露的一方面提供了制备冻干配制品的方法，其中该方法缺少退火步骤。该方法包括：(a)冷却含有具有约3-7的ph并且包含蛋白质、糖以及表面活性剂，并且缺少甘露糖醇的液体配制品的冻干室，至约-35℃至约-50℃的温度范围，以产生冷冻配制品，并且将该室在约-40℃至约-50℃的温度范围保持约2小时至约24小时的时间段；(b)加热该室至约-30℃至约-20℃的温度范围和约25毫托至约100毫托的压力范围以产生初次干燥配制品，并且将该室在约-30℃至约-20℃的温度范围下和约25毫托至约100毫托的压力范围下保持约45小时至约60小时的时间段；以及(c)加热该室至约20℃至约35℃的温度范围以产生二次干燥配制品，并且将该室在约20℃至约30℃的温度范围下和约25毫托至约100毫托的压力范围下保持约5小时至约10小时的时间段，以产生该冻干配制品。如本文所用，术语“温度”是指冻干室内部的温度(即，冻干室的内部温度，“内部温度”)。同样地，如本文所用，术语“压力”是指冻干室内部的压力(即，冻干室的内部压力，“内部压力”)。[0026]步骤(a).在步骤(a)中，将含有液体配制品的冻干室冷却至约-35℃至约-50℃的温度(例如，内部温度)范围，以产生冷冻配制品，并且在约-40℃至约-50℃的温度(例如，内部温度)范围下保持约2小时至约24小时的时间段。在一些实施例中，冷却进行至约-40℃至约-50℃(例如，约-40℃、-41℃、-42℃、-43℃、-44℃、-45℃、-46℃、-47℃、-48℃、-49℃、或-50℃)的温度范围。在各种情况下，冷却可以进行至约-45℃的温度。在一些情况下，室的冷却以约0.5℃/min至约1℃/min的速率范围进行。在多个实施例中，冷却以约0.5℃/min至约0.8℃/min的速率进行。在一些实施例中，冷却以约0.5℃/min、0.6℃/min、0.7℃/min、0.8℃/min、0.9℃/min、或1℃/min的速率进行。在一些情况下，冷却以约0.5℃/min的速率进行。在一些实施例中，室的保持可以在约-40℃、-41℃、-42℃、-43℃、-44℃、-45℃、-46℃、-47℃、-48℃、-49℃、或-50℃的温度下进行。在一些实施例中，保持在约-45℃的温度下进行。在一些实施例中，冻干室冷却达到的温度和保持温度是相同的。在多个实施例中，保持进行约2小时至约5小时(例如，约2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、或5小时)的时间段。在一些情况下，保持进行约2小时。[0027]步骤(b).在步骤(b)中，加热冻干室至约-30℃至约-20℃的温度(例如，内部温度)范围和约25毫托至约100毫托的压力(例如，内部压力)范围，以产生初次干燥配制品，并且在约-30℃至约-20℃的温度(例如，内部温度)范围和约25毫托至约100毫托的压力(例如，内部压力)范围保持约45小时至约60小时的时间段。在一些实施例中，加热进行至约-30℃、-29℃、-28℃、-27℃、-26℃、-25℃、-24℃、-23℃、-22℃、-21℃、或-20℃的温度。在各种情况下，加热进行至约-25℃的温度。在一些情况下，加热以约0.1℃/min至约1℃/min的速率范围进行。在多个实施例中，加热以约0.1℃/min至约0.5℃/min(例如，0.1℃/min、0.2℃/min、0.3℃/min、0.4℃/min、或0.5℃/min)的速率进行。在一些情况下，加热以约0.3℃/min的速率进行。在各种情况下，加热在约25毫托至约75毫托、或约50毫托至约100毫托、或约70毫托至约100毫托、或约65毫托至约75毫托的压力范围下进行。在一些情况下，加热在约65毫托、66毫托、67毫托、68毫托、69毫托、70毫托、71毫托、72毫托、73毫托、74毫托、或75毫托的压力下进行。在多个实施例中，加热在约70毫托的压力下进行。在一些实施例中，室的保持在约-30℃、-29℃、-28℃、-27℃、-26℃、-25℃、-24℃、-23℃、-22℃、-21℃、或-20℃的温度下进行。在各种情况下，保持在约-25℃的温度下进行。在多个实施例中，保持在约25毫托至约75毫托、或约50毫托至约100毫托、或约70毫托至约100毫托、或约65毫托至约75毫托的压力范围下进行。在一些情况下，保持在约65毫托、66毫托、67毫托、68毫托、69毫托、70毫托、71毫托、72毫托、73毫托、74毫托、或75毫托的压力下进行。在多个实施例中，保持在约70毫托的压力下进行。在一些实施例中，冻干室加热达到的温度和保持温度是相同的。在一些实施例中，加热冻干室所处的压力和保持压力是相同的。在一些实施例中，加热冻干室所处的温度和保持温度是相同的，并且加热冻干室所处的压力和保持压力也是相同的。在一些情况下，保持进行约50小时至约55小时(例如，约50小时、51小时、52小时、53小时、54小时、或55小时)的时间段。在各种情况下，保持进行约52小时的时间段。[0028]步骤(c).在步骤(c)中，加热该室至约20℃至约35℃的温度(例如，内部温度)范围以产生二次干燥配制品，并且在约20℃至约30℃的温度(例如，内部温度)范围和约25毫托至约100毫托的压力(例如，内部压力)范围下保持约5小时至约10小时的时间段以产生冻干配制品。在一些实施例中，加热进行至约20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、或35℃的温度。在各种情况下，加热进行至约30℃的温度。在多个实施例中，加热以高达约0.5℃/min的速率范围进行以产生二次干燥配制品。在一些情况下，加热以约0.05℃/min至约0.5℃/min的速率进行。在各种情况下，加热以约0.05℃/min、0.1℃/min、0.15℃/min、0.2℃/min、0.25℃/min、0.3℃/min、0.35℃/min、0.4℃/min、0.45℃/min、或0.5℃/min的速率进行。在一些实施例中，加热以约0.1℃/min的速率进行。在一些实施例中，保持在约20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、或30℃的温度下进行。在各种情况下，保持在约30℃的温度下进行。在一些实施例中，冻干室加热达到的温度和保持温度是相同的。在一些实施例中，保持在约25毫托至约75毫托、或约50毫托至约100毫托、或约70毫托至约100毫托、或约65毫托至约75毫托的压力范围下进行。在一些情况下，保持在约65毫托、66毫托、67毫托、68毫托、69毫托、70毫托、71毫托、72毫托、73毫托、74毫托、或75毫托的压力下进行。在多个实施例中，保持在约70毫托的压力下进行。在一些情况下，保持进行约5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、或10小时的时间段。在各种情况下，保持进行约8小时的时间段。[0029]本披露的另一方面提供了制备冻干配制品的方法，其中该方法包括退火步骤。此方面的方法包括：(a)冷却含有具有约3-7的ph并且包含蛋白质、糖以及表面活性剂，并且缺少甘露糖醇的液体配制品的冻干室，至约-35℃至约-50℃的温度范围，以产生冷冻配制品，并且将该室在约-40℃至约-50℃的温度范围保持约2小时至约24小时的时间段；(b)加热该室至约-30℃至约-20℃的温度范围和约25毫托至约100毫托的压力范围以产生初次干燥配制品，并且将该室在约-30℃至约-20℃的温度范围下和约25毫托至约100毫托的压力范围下保持约45小时至约60小时的时间段；以及(c)加热该室至约20℃至约35℃的温度范围以产生二次干燥配制品，并且将该室在约20℃至约30℃的温度范围下和约25毫托至约100毫托的压力范围下保持约5小时至约10小时的时间段，以产生该冻干配制品，如前所述(同上)，但在步骤(a)和(b)之间具有退火步骤。如本文所用，“退火”是指使配制品的温度(例如，从低温至较高温度，并且然后返回至低温)循环以获得更完整的结晶的过程。在实施例中，退火步骤可包括：(i)加热含有来自步骤(a)的冷冻配制品的室并且将该室在加热温度下保持一段时间；以及(ii)将含有冷冻配制品的室冷却至步骤(a)的温度，并且将含有冷冻配制品的室保持在约-35℃至约-50℃温度范围下约2小时至约24小时的时间段。[0030]步骤(i).在步骤(i)中，来自步骤(a)的冷冻配制品的加热可以以约0.1℃/min至约1℃/min的速率范围进行至约-20℃至约-5℃的温度范围。在一些实施例中，加热进行至约-20℃、-19℃、-18℃、-17℃、-16℃、-15℃、-14℃、-13℃、-12℃、-11℃、-10℃、-9℃、-8℃、-7℃、-6℃、或-5℃的温度。在一些实施例中，加热进行至约-15℃至约-10℃的温度范围。在各种情况下，加热进行至约-12℃的温度。在多个实施例中，加热以约0.1℃/min至约0.5℃/min(例如，0.1℃/min、0.2℃/min、0.3℃/min、0.4℃/min、或0.5℃/min)的速率进行。在一些情况下，加热以约0.5℃/min的速率进行。冷冻配制品的保持可以在约-20℃至约-5℃的温度范围下进行约2小时至约10小时的时间段。在一些实施例中，保持进行至约-20℃、-19℃、-18℃、-17℃、-16℃、-15℃、-14℃、-13℃、-12℃、-11℃、-10℃、-9℃、-8℃、-7℃、-6℃、或-5℃的温度。在一些实施例中，保持在约-15℃至约-10℃的温度范围下进行。在各种情况下，保持在约-12℃的温度下进行。在多个实施例中，保持进行约2小时至约5小时(例如，约2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、或5小时)的时间段。在一些情况下，保持进行约2小时。[0031]步骤(ii).在步骤(ii)中，冷却可以以约0.5℃/min至约1℃/min的速率范围进行至约-35℃至约-50℃的温度范围。在一些实施例中，冷却进行至约-40℃至约-50℃(例如，约-40℃、-41℃、-42℃、-43℃、-44℃、-45℃、-46℃、-47℃、-48℃、-49℃、或-50℃)的温度范围。在各种情况下，冷却进行至约-45℃的温度。在多个实施例中，冷却以约0.5℃/min至约0.8℃/min的速率进行。在一些实施例中，冷却以约0.5℃/min、0.6℃/min、0.7℃/min、0.8℃/min、0.9℃/min、或1℃/min的速率进行。在一些情况下，冷却以约0.5℃/min的速率进行。在一些实施例中，保持可以在约-40℃至约-50℃的温度范围下进行约2小时至约24小时的时间段。在一些实施例中，保持在约-40℃、-41℃、-42℃、-43℃、-44℃、-45℃、-46℃、-47℃、-48℃、-49℃、或-50℃的温度下进行。在一些实施例中，保持在约-45℃的温度下进行。在多个实施例中，保持进行约2小时至约5小时(例如，约2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、或5小时)的时间段。在一些情况下，保持进行约2小时。[0032]在本文披露的任一方法(含有或不含有退火步骤)的实施例中，该方法可以进一步包括步骤(d)冷却包含步骤(c)的冻干配制品的室至约1℃至约10℃(或至约2℃至约7℃、或至约5℃)的温度范围，并且在约250毫托至约750毫托(或至约300毫托至约600毫托、或至约500毫托)的压力下，用惰性气体对冻干配制品充气。在一些情况下，惰性气体选自氩气、氦气、氮气以及其任何组合。在各种情况下，惰性气体是氮气。在实施例中，步骤(d)可促进塞住含有冻干配制品的容器(例如小瓶)。在实施例中，该方法进一步包括将冻干配制品在约2℃至约8℃的温度范围下储存。在实施例中，该方法进一步包括用水重构冻干配制品。[0033]在又另一方面，本披露提供了通过本文披露的方法制备的冻干蛋白配制品。在一些实施例中，通过本文披露的方法制备蛋白配制品，该方法缺少退火步骤。在多个实施例中，本文披露的方法包括退火步骤。[0034]冻干蛋白配制品[0035]本文所述的冻干蛋白配制品包括蛋白质、糖、表面活性剂以及任选地缓冲液，并且具有约3至约7(或约3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、或7)的ph。在一些情况下，ph为约4至约6。在一些情况下，配制品的ph为约4、或约4.2。在各种情况下，配制品的ph为约5。在一些实施例中，配制品的ph为约6。在实施例中，本文披露的冻干配制品不含有糖醇。如本文所用，“糖醇”是指其中每个碳原子附接一个羟基基团的线性多元醇。如本文所用的糖醇的实例包括木糖醇、赤藓糖醇、甘露糖醇以及山梨糖醇。在实施例中，冻干配制品不含有甘露糖醇。[0036]蛋白质[0037]在一些实施例中，冻干配制品的蛋白质是抗原结合蛋白。“抗原结合蛋白”是包含结构域的蛋白质，该结构域与特定的靶抗原(如cd3和/或cdh19、msln、dll3、flt3、egfrvlll、bcma、psma、cd33、cd19、cd70、cldn18.2、或muc17)结合。抗原结合蛋白包含支架或框架部分，其允许抗原结合结构域采用促进抗原结合蛋白与抗原结合的构象。[0038]在一些实施例中，冻干配制品的抗原结合蛋白是抗体或免疫球蛋白、或抗原结合抗体片段。在一些情况下，抗原结合蛋白是抗体。术语“抗体”是指完整的抗原结合免疫球蛋白。“抗体”是一种抗原结合蛋白。抗体可以是iga、igd、ige、igg、或igm抗体，包括igg1、igg2、igg3或igg4中的任一种。在多个实施例中，完整抗体包含两条全长重链和两条全长轻链。抗体具有可变区和恒定区。在igg形式中，可变区通常为约100-110或更多个氨基酸，包含三个互补决定区(cdr)，主要负责抗原识别，并且与结合不同抗原的其他抗体差异很大。可变区典型地包含至少三个重链cdr或三个轻链cdr(kabat等人,1991,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest[免疫相关蛋白质序列],publichealthservice[公共卫生署]n.i.h.,贝塞斯达,马里兰州；还参见chothia和lesk,1987,j.mol.biol.[分子生物学杂志]196:901-917；chothia等人,1989,nature[自然]342:877-883)，位于框架区内(由kabat等人,1991指定框架区1-4、fr1、fr2、fr3、和fr4；还参见chothia和lesk,1987,同上)。恒定区允许抗体募集免疫系统的细胞和分子。[0039]在一些实施例中，配制品的抗体是双特异性抗体，即结合两种不同靶标(例如，cd3和不同的第二靶标)的抗体。如本文所用，术语“双特异性”是指与两种不同靶抗原结合的抗体构建体，即，其包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中该第一结合结构域与一种抗原或靶标(例如，靶细胞表面抗原)结合，并且该第二结合结构域与另一种抗原或靶标(例如，cd3)结合。因此，根据本披露的抗体构建体包含针对两种不同抗原或靶标的特异性。术语“靶细胞表面抗原”是指由细胞表达并且存在于细胞表面以使得为如本文所述的抗体构建体所接近的抗原结构。靶细胞表面抗原可以是蛋白质，如蛋白质的细胞外部分，或碳水化合物结构，如蛋白质的碳水化合物结构，如糖蛋白。靶细胞表面抗原可以是肿瘤抗原。本披露还涵盖多特异性抗体构建体，如三特异性抗体构建体，后者包括三个结合结构域，或具有超过三种(例如四种、五种或更多种)特异性的构建体。[0040]如本文所理解的双特异性抗体和/或抗体构建体包括但不限于传统的双特异性免疫球蛋白(例如，bsigg)、包含附加的抗原结合结构域的igg(例如，轻链或重链的氨基或羧基末端连接到另外的抗原结合结构域，如单结构域抗体或成对抗体可变结构域(例如，fv或scfv))、bsab片段(例如，双特异性单链抗体)、双特异性融合蛋白(例如，与效应子部分融合的抗原结合结构域)和bsab缀合物。参见，例如，spiess等人,molecularimmunology[分子免疫学]67(2)部分a:97-106(2015)，其描述了各种双特异性形式并通过引用并入文中。双特异性构建体的实例包括但不限于双抗体、单链双抗体、串联scfv、双特异性t细胞接合剂形式(由通过接头连接的两个单链可变片段(scfv)组成的融合蛋白)、和fab2双特异性抗体、以及包含全长抗体的工程化构建体。参见，例如，chames和baty,2009,mabs[单克隆抗体]1[6]:1-9；和holliger和hudson,2005,naturebiotechnology[自然生物技术]23[9]:1126-1136；wu等人,2007,naturebiotechnology[自然生物技术]25[11]:1290-1297；michaelson等人,2009,mabs[单克隆抗体]1[2]:128-141；国际专利公开号2009032782和2006020258；zuo等人,2000,proteinengineering[蛋白质工程]13[5]:361-367；美国专利申请公开号20020103345；shen等人,2006,jbiolchem[生物化学杂志]281[16]:10706-10714；lu等人,2005,jbiolchem[生物化学杂志]280[20]:19665-19672；以及kontermann,2012mabs[单克隆抗体]4(2):182，所有这些都明确地并入本文。[0041]在一些实施例中，本文所述的冻干配制品包含双特异性抗体构建体，该双特异性抗体构建体包含与靶细胞表面抗原结合的第一结合结构域、与t细胞表面上的人cd3结合的第二结合结构域，以及任选地按氨基到羧基的顺序包含铰链-ch2结构域-ch3结构域-接头-铰链-ch2结构域-ch3结构域的第三结构域。在一些实施例中，第一结合结构域和第二结合结构域中的每一者包含vh区和vl区。[0042]如本文所用，术语“结合结构域”是指(特异性地)结合至靶分子(抗原)上的给定靶表位或给定靶位点/与该靶表位或靶位点相互作用/识别该靶表位或靶位点的结构域，这些靶分子(抗原)例如分别为cdh19、msln、dll3、flt3、egfrvlll、bcma、psma、cd33、cd19、cd70、cldn18.2或muc17以及cd3。[0043]第一结合结构域(识别例如cdh19、msln、dll3、flt3、egfrvlll、bcma、psma、cd33、cd19、cd70、cldn18.2或muc17)的结构和功能，以及还有第二结合结构域(识别cd3)的结构和/或功能是基于抗体，例如全长或完整免疫球蛋白分子的结构和/或功能，和/或是从抗体或其片段的可变重链(vh)和/或可变轻链(vl)结构域中提取。在实施例中，第一结合结构域的特征在于存在三个轻链cdr(即vl区的cdr1、cdr2和cdr3)和/或三个重链cdr(即vh区的cdr1、cdr2和cdr3)。在实施例中，第二结合结构域还包含允许靶结合的抗体的最小结构要求。在实施例中，第二结合结构域包含至少三个轻链cdr(即vl区的cdr1、cdr2和cdr3)和/或三个重链cdr(即vh区的cdr1、cdr2和cdr3)。设想第一结合结构域和/或第二结合结构域是通过噬菌体展示或文库筛选方法产生或可获得的，而不是通过将cdr序列从预先存在的(单克隆)抗体移植到支架中产生或可获得的。[0044]在一些实施例中，与靶细胞表面抗原结合的第一结合结构域和/或与cd3ε结合的第二结合结构域是人结合结构域。包含至少一种人结合结构域的抗体和抗体构建体避免了与具有非人如啮齿动物(例如鼠、大鼠、仓鼠或兔)可变区和/或恒定区的抗体或抗体构建体相关的一些问题。这种啮齿动物来源的蛋白质的存在可以导致抗体或抗体构建体的快速清除，或者可以导致患者生成针对抗体或抗体构建体的免疫应答。为了避免使用啮齿动物衍生的抗体或抗体构建体，可以通过将人抗体功能引入到啮齿动物中以使啮齿动物产生完全人抗体来生成人或完全人抗体/抗体构建体。[0045]在一些实施例中，抗原结合蛋白包含单链抗体构建体。scfv包含可变重链、scfv接头和可变轻链结构域。任选地，可变轻链的c末端附接至scfv接头的n末端，该接头的c末端附接至可变重链的n末端(n-vh-接头-vl-c)，虽然可以转换构型(n-vl-接头-vh-c)。可替代地，可变重链的c末端附接至scfv接头的n末端，该接头的c末端附接至可变轻链的n末端(n-vl-接头-vh-c)，虽然可以转换构型(n-vh-接头-v-c)。因此，scfv的描绘和说明中特别包括的是任一取向的scfv。[0046]本披露的抗体构建体的至少两个结合结构域和可变结构域(vh/vl)可以包含或可以不包含肽接头(间隔肽)。根据本披露，术语“肽接头”包含这样的氨基酸序列：通过该氨基酸序列，本披露的抗体构建体的一个(可变和/或结合)结构域和另一(可变和/或结合)结构域的氨基酸序列彼此连接。肽接头也可以用于将第三结构域与本披露的抗体构建体的其他结构域融合。这样的肽接头的特征在于它不包含任何聚合活性。合适的肽接头是在美国专利4,751,180和4,935,233或wo88/09344中描述的那些，将其披露内容通过引用以其整体并入本文。肽接头也可用于将其他结构域或模块或区(如半衰期延长的结构域)附接到本文所述的双特异性抗体构建体。[0047]在一些实施例中，第三结构域包含“fc”或“fc区”或“fc结构域”，该“fc”或“fc区”或“fc结构域”是指包含除第一恒定区免疫球蛋白结构域之外的抗体的恒定区的多肽。因此，“fc结构域”是指iga、igd和igg的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域、ige和igm的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域、和在这些结构域的n末端的柔性铰链。对于iga和igm，fc可以包括j链。对于igg，fc结构域包含免疫球蛋白结构域cγ2和cγ3(cγ2和cγ3)以及cγ1(cγ1)和cγ2(cγ2)之间的下铰链区。在一些实施例中，双特异性抗体构建体是igg抗体(其包括几个亚类，包括但不限于igg1、igg2、igg3以及igg4)。尽管fc区的边界可以变化，人igg重链fc区通常定义为在其羧基末端包括残基c226或p230，其中根据如在kabat中的eu索引进行编号。在一些实施例中，对fc区进行氨基酸修饰，例如，以改变与一种或多种fcγr受体或fcrn受体的结合。[0048]在一些实施例中，本文所述的配制品包含双特异性抗体构建体，该双特异性抗体构建体与人cd3和人cdh19、或人cd3和人msln、或人cd3和人dll3、或人cd3和人flt3、或人cd3和人egfrviii、或人cd3和人bcma、或人cd3和psma、或人cd3和人cd33、或人cd3和人cd19、人cd3和人cd70、或人cd3和人muc17、或人cd3和人cldn18.2结合。[0049]在一些实施例中，双特异性抗体构建体的第一结合结构域包含以下列出的一组6个cdr：(a)seqidno:24-29，(b)seqidno:34-39，(c)seqidno:78-83，(d)seqidno:10-15，(e)seqidno:46-51，(f)seqidno:88-93，(g)seqidno:67-72，(h)seqidno:56-61，(i)seqidno:112-117，(j)seqidno:100-105，(k)seqidno:148-153、seqidno:157-162、或seqidno:166-171、或seqidno:175-180，(l)seqidno:132-137，或(m)seqidno:123-128。[0050]在一些实施例中，双特异性抗体构建体的第一结合结构域包含vh区，该vh区包含与seqidno:30、40、84、16、17、52、94、73、62、118、154、163、172、181、106、138、143、或129中列出的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性抗体构建体的第一结合结构域包含vh，该vh包含seqidno:30、40、84、16、17、52、94、73、62、118、154、163、172、181、106、138、143、或129中列出的氨基酸序列。[0051]在一些实施例中，双特异性抗体构建体的第一结合结构域包含vl区，该vl区包含与seqidno:31、41、85、18、19、53、95、74、63、119、155、164、173、182、107、139、144、或130中列出的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性抗体构建体的第一结合结构域包含vl，该vl包含seqidno:31、41、85、18、19、53、95、74、63、119、155、164、173、182、107、139、144、或130中列出的氨基酸序列。[0052]在一些实施例中，其中第一结合结构域包含(a)vh区，该vh区包含seqidno:30中列出的氨基酸序列，以及vl区，该vl区包含seqidno:31中列出的氨基酸序列；(b)vh区，该vh区包含seqidno:40中列出的氨基酸序列，以及vl区，该vl区包含seqidno:41中列出的氨基酸序列；(c)vh区，该vh区包含seqidno:84中列出的氨基酸序列，以及vl区，该vl区包含seqidno:85中列出的氨基酸序列；(d)vh区，该vh区包含seqidno:16或17中列出的氨基酸序列，以及vl区，该vl区包含seqidno:18或19中列出的氨基酸序列；(e)vh区，该vh区包含seqidno:52中列出的氨基酸序列，以及vl区，该vl区包含seqidno:53中列出的氨基酸序列；(f)vh区，该vh区包含seqidno:94中列出的氨基酸序列，以及vl区，该vl区包含seqidno:95中列出的氨基酸序列；(g)vh区，该vh区包含seqidno:73中列出的氨基酸序列，以及vl区，该vl区包含seqidno:74中列出的氨基酸序列；(h)vh区，该vh区包含seqidno:62中列出的氨基酸序列，以及vl区，该vl区包含seqidno:63中列出的氨基酸序列；(i)vh区，该vh区包含seqidno:118中列出的氨基酸序列，以及vl区，该vl区包含seqidno:119中列出的氨基酸序列；(j)vh区，该vh区包含seqidno:154、163、172、或181中列出的氨基酸序列，以及vl区，该vl区包含seqidno:155、164、173、或182中列出的氨基酸序列；(k)vh区，该vh区包含seqidno:106中列出的氨基酸序列，以及vl区，该vl区包含seqidno:107中列出的氨基酸序列；(l)vh区，该vh区包含seqidno:138或143中列出的氨基酸序列，以及vl区，该vl区包含seqidno:139或144中列出的氨基酸序列；或(m)vh区，该vh区包含seqidno:129中列出的氨基酸序列，以及vl区，该vl区包含seqidno:130中列出的氨基酸序列。[0053]在一些实施例中，双特异性抗体构建体的第二结合结构域包含seqidno:1-6中列出的一组6个cdr。[0054]在一些实施例中，双特异性抗体构建体的第二结合结构域包含vh区，该vh区包含与seqidno:7中列出的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性抗体构建体的第二结合结构域包含vh，该vh包含seqidno:7中列出的氨基酸序列。[0055]在一些实施例中，双特异性抗体构建体的第二结合结构域包含vl区，该vl区包含与seqidno:8中列出的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性抗体构建体的第二结合结构域包含vl，该vl包含seqidno:8中列出的氨基酸序列。[0056]在一些实施例中，其中第二结合结构域包含(a)vh区，该vh区包含seqidno:7中列出的氨基酸序列，以及vl区，该vl区包含seqidno:8中列出的氨基酸序列。[0057]在一些实施例中，双特异性抗体构建体包含与cd19结合的第一结合结构域，该第一结合结构域包含含有seqidno:85的氨基酸序列的抗cd19可变轻链结构域以及含有seqidno:84的氨基酸序列的抗cd19可变重链结构域，第二结合结构域，该第二结合结构域包含含有seqidno:7的氨基酸序列的抗cd3可变重链结构域以及含有seqidno:8的氨基酸序列的抗cd3可变轻链结构域。例如，在一个实施例中，双特异性抗体构建体包含第一结合结构域，该第一结合结构域包含seqidno:86的氨基酸序列，和第二结合结构域，该第二结合结构域包含seqidno:9的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性抗体构建体包含seqidno:87中列出的氨基酸序列。[0058]在一些实施例中，双特异性抗体构建体包含与msln结合的第一结合结构域，该第一结合结构域包含含有seqidno:41的氨基酸序列的抗msln可变轻链结构域以及含有seqidno:40的氨基酸序列的抗msln可变重链结构域，第二结合结构域，该第二结合结构域包含含有seqidno:7的氨基酸序列的抗cd3可变重链结构域以及含有seqidno:8的氨基酸序列的抗cd3可变轻链结构域。例如，在一个实施例中，双特异性抗体构建体包含第一结合结构域，该第一结合结构域包含seqidno:42的氨基酸序列，和第二结合结构域，该第二结合结构域包含seqidno:9的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性抗体构建体包含seqidno:43、44或45中列出的氨基酸序列。[0059]在一些实施例中，双特异性抗体构建体包含与dll3结合的第一结合结构域，该第一结合结构域包含含有seqidno:74的氨基酸序列的抗dll3可变轻链结构域以及含有seqidno:73的氨基酸序列的抗dll3可变重链结构域，第二结合结构域，该第二结合结构域包含含有seqidno:7的氨基酸序列的抗cd3可变重链结构域以及含有seqidno:8的氨基酸序列的抗cd3可变轻链结构域。例如，在一个实施例中，双特异性抗体构建体包含第一结合结构域，该第一结合结构域包含seqidno:75的氨基酸序列，和第二结合结构域，该第二结合结构域包含seqidno:9的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性抗体构建体包含seqidno:76或77中列出的氨基酸序列。[0060]在一些实施例中，双特异性抗体构建体包含与flt3结合的第一结合结构域，该第一结合结构域包含含有seqidno:63的氨基酸序列的抗flt3可变轻链结构域以及含有seqidno:62的氨基酸序列的抗flt3可变重链结构域，第二结合结构域，该第二结合结构域包含含有seqidno:7的氨基酸序列的抗cd3可变重链结构域以及含有seqidno:8的氨基酸序列的抗cd3可变轻链结构域。例如，在一个实施例中，双特异性抗体构建体包含第一结合结构域，该第一结合结构域包含seqidno:64的氨基酸序列，第二结合结构域，该第二结合结构域包含seqidno:9的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性抗体构建体包含seqidno:65或66中列出的氨基酸序列。[0061]在一些实施例中，双特异性抗体构建体包含与egfrviii结合的第一结合结构域，该第一结合结构域包含含有seqidno:31的氨基酸序列的抗egfrviii可变轻链结构域以及含有seqidno:30的氨基酸序列的抗egfrviii可变重链结构域，第二结合结构域，该第二结合结构域包含含有seqidno:7的氨基酸序列的抗cd3可变重链结构域以及含有seqidno:8的氨基酸序列的抗cd3可变轻链结构域。例如，在一个实施例中，双特异性抗体构建体包含第一结合结构域，该第一结合结构域包含seqidno:32的氨基酸序列，第二结合结构域，该第二结合结构域包含seqidno:9的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性抗体构建体包含seqidno:33中列出的氨基酸序列。[0062]在一些实施例中，双特异性抗体构建体包含与bcma结合的第一结合结构域，该第一结合结构域包含含有seqidno:95的氨基酸序列的抗bcma可变轻链结构域以及含有seqidno:94的氨基酸序列的抗bcma可变重链结构域，第二结合结构域，该第二结合结构域包含含有seqidno:7的氨基酸序列的抗cd3可变重链结构域以及含有seqidno:8的氨基酸序列的抗cd3可变轻链结构域。例如，在一个实施例中，双特异性抗体构建体包含第一结合结构域，该第一结合结构域包含seqidno:96的氨基酸序列，第二结合结构域，该第二结合结构域包含seqidno:9的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性抗体构建体包含seqidno:98或seqidno:97中列出的氨基酸序列。[0063]在一些实施例中，双特异性抗体构建体包含与psma结合的第一结合结构域，该第一结合结构域包含含有seqidno:119或107的氨基酸序列的抗psma可变轻链结构域以及含有seqidno:118或106的氨基酸序列的抗psma可变重链结构域，第二结合结构域，该第二结合结构域包含含有seqidno:7的氨基酸序列的抗cd3可变重链结构域以及含有seqidno:8的氨基酸序列的抗cd3可变轻链结构域。例如，在一个实施例中，双特异性抗体构建体包含第一结合结构域，该第一结合结构域包含seqidno:120或108的氨基酸序列，第二结合结构域，该第二结合结构域包含seqidno:9的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性抗体构建体包含seqidno:121、122、109、110或111中列出的氨基酸序列。[0064]在一些实施例中，双特异性抗体构建体包含与cd33结合的第一结合结构域，该第一结合结构域包含含有seqidno:18或19的氨基酸序列的抗cd33可变轻链结构域以及含有seqidno:16或17的氨基酸序列的抗cd33可变重链结构域，第二结合结构域，该第二结合结构域包含含有seqidno:7的氨基酸序列的抗cd3可变重链结构域以及含有seqidno:8的氨基酸序列的抗cd3可变轻链结构域。例如，在一个实施例中，双特异性抗体构建体包含第一结合结构域，该第一结合结构域包含seqidno:189或190的氨基酸序列，第二结合结构域，该第二结合结构域包含seqidno:9的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性抗体构建体包含seqidno:20、21、22或23中列出的氨基酸序列。[0065]在一些实施例中，双特异性抗体构建体包含与cdh19结合的第一结合结构域，该第一结合结构域包含含有seqidno:53的氨基酸序列的抗cdh19可变轻链结构域以及含有seqidno:52的氨基酸序列的抗cdh19可变重链结构域，第二结合结构域，该第二结合结构域包含含有seqidno:7的氨基酸序列的抗cd3可变重链结构域以及含有seqidno:8的氨基酸序列的抗cd3可变轻链结构域。例如，在一个实施例中，双特异性抗体构建体包含第一结合结构域，该第一结合结构域包含seqidno:54的氨基酸序列，第二结合结构域，该第二结合结构域包含seqidno:9的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性抗体构建体包含seqidno:55中列出的氨基酸序列。[0066]在一些实施例中，双特异性抗体构建体包含与muc17结合的第一结合结构域，该第一结合结构域包含含有seqidno:155、164、173、或182的氨基酸序列的抗muc17可变轻链结构域以及含有seqidno:154、163、172、或181的氨基酸序列的抗muc17可变重链结构域，和第二结合结构域，该第二结合结构域包含含有seqidno:7的氨基酸序列的抗cd3可变重链结构域以及含有seqidno:8的氨基酸序列的抗cd3可变轻链结构域。在一些实施例中，双特异性抗体构建体包含seqidno:156、165、174或183中列出的氨基酸序列。[0067]在一些实施例中，双特异性抗体构建体包含与cldn18.2结合的第一结合结构域，该第一结合结构域包含含有seqidno:139或144的氨基酸序列的抗cldn18.2可变轻链结构域以及含有seqidno:138或143的氨基酸序列的抗cldn18.2可变重链结构域，第二结合结构域，该第二结合结构域包含含有seqidno:7的氨基酸序列的抗cd3可变重链结构域以及含有seqidno:8的氨基酸序列的抗cd3可变轻链结构域。例如，在一个实施例中，双特异性抗体构建体包含第一结合结构域，该第一结合结构域包含seqidno:140或145的氨基酸序列，和第二结合结构域，该第二结合结构域包含seqidno:9的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性抗体构建体包含seqidno:141、142、146或147中列出的氨基酸序列。[0068]在一些实施例中，双特异性抗体构建体包含与cd70结合的第一结合结构域，该第一结合结构域包含含有seqidno:130的氨基酸序列的抗cd70可变轻链结构域以及含有seqidno:129的氨基酸序列的抗cd70可变重链结构域，第二结合结构域，该第二结合结构域包含含有seqidno:7的氨基酸序列的抗cd3可变重链结构域以及含有seqidno:8的氨基酸序列的抗cd3可变轻链结构域。在一些实施例中，双特异性抗体构建体包含seqidno:131中列出的氨基酸序列。[0069]在一些实施例中，配制品的蛋白质是抗体。在多个实施例中，配制品的蛋白质是双特异性抗体构建体。在一些情况下，配制品的蛋白质是半衰期延长的双特异性抗体构建体。半衰期延长的双特异性抗体构建体先前已在本文中描述。在一些实施例中，本披露的蛋白配制品包含seqidno:1-190中列出的氨基酸序列。在多个实施例中，本披露的蛋白配制品包含以下列出的氨基酸序列：seqidno:20、seqidno:21、seqidno:22、seqidno:23、seqidno:33、seqidno:43、seqidno:44、seqidno:45、seqidno:55、seqidno:65、seqidno:66、seqidno:55、seqidno:76、seqidno:77、seqidno:87、seqidno:97、seqidno:98、seqidno:99、seqidno:109、seqidno:110、seqidno:111、seqidno:121、seqidno:122、seqidno:131、seqidno:141、seqidno:142、seqidno:146、seqidno:147、seqidno:156、seqidno:165、seqidno:174、seqidno:183、seqidno:184、seqidno:185、seqidno:186、seqidno:187、或seqidno:188。在一些情况下，本披露的蛋白配制品包含以下列出的氨基酸序列：seqidno:22(bitea)、seqidno:77(biteb)、seqidno:87(bitec)、或seqidno:97(bited)。[0070]在一些实施例中，蛋白质，如抗体或双特异性抗体构建体(例如hle双特异性抗体构建体)以约0.1mg/ml至约100mg/ml(或约0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml、50mg/ml、55mg/ml、60mg/ml、65mg/ml、70mg/ml、75mg/ml、80mg/ml、85mg/ml、90mg/ml、95mg/ml、或100mg/ml)的量的范围存在于液体配制品(冻干前)中。在多个实施例中，蛋白质以约0.1mg/ml至约70mg/ml的量的范围存在于液体配制品中。在一些情况下，蛋白质以约0.5mg/ml至约30mg/ml(或约0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、11mg/ml、12mg/ml、13mg/ml、14mg/ml、15mg/ml、16mg/ml、17mg/ml、18mg/ml、19mg/ml、20mg/ml、21mg/ml、22mg/ml、23mg/ml、24mg/ml、25mg/ml、26mg/ml、27mg/ml、28mg/ml、29mg/ml、或30mg/ml)的量范围存在于液体配制品中。在各种情况下，蛋白质以约1mg/ml至约20mg/ml(或约1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml、3mg/ml、3.5mg/ml、4mg/ml、4.5mg/ml、5mg/ml、5.5mg/ml、6mg/ml、6.5mg/ml、7mg/ml、7.5mg/ml、8mg/ml、8.5mg/ml、9mg/ml、9.5mg/ml、10mg/ml、10.5mg/ml、11mg/ml、11.5mg/ml、12mg/ml、12.5mg/ml、13mg/ml、13.5mg/ml、14mg/ml、14.5mg/ml、15mg/ml、15.5mg/ml、16mg/ml、16.5mg/ml、17mg/ml、17.5mg/ml、18mg/ml、18.5mg/ml、19mg/ml、19.5mg/ml、或20mg/ml)的量的范围存在于液体配制品中。在一些实施例中，蛋白质以约1mg/ml的量存在于液体配制品中。[0071]糖[0072]本披露的蛋白配制品包含糖。在一些实施例中，糖是单糖或二糖。合适的糖包括，例如葡萄糖、半乳糖、果糖、木糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖或其任何组合。在一些情况下，糖包含蔗糖。[0073]在一些实施例中，液体配制品(冻干前)包含浓度为约1％至约15％w/v、或约4％至约13％w/v、或约6％至约12％w/v的糖。在一些实施例中，液体配制品包含浓度为至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、或至少14％w/v的糖。在一些实施例中，液体配制品包含浓度为约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、或约15％w/v的糖。在一些实施例中，液体配制品包含浓度为约7％、约7.5％、约8％、约8.5％、约9％、约9.5％、约10％、约10.5％、约11％、约11.5％、或约12％w/v的糖。在一些实施例中，液体配制品包含浓度为约7％至约12％w/v的糖。在一些实施例中，液体配制品包含浓度为约9％w/v的糖。在一些实施例中，糖是蔗糖，并且以约6％至约12％w/v的浓度范围存在于液体配制品中。在一些情况下，糖是蔗糖，并且以约9％w/v的浓度存在于液体配制品中。[0074]表面活性剂[0075]本披露的蛋白配制品包含表面活性剂。合适的表面活性剂包括聚山梨醇酯、泊洛沙姆、聚氧乙烯、或其任何组合。预期的表面活性剂包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、曲拉通x-100、聚氧乙烯、peg3350、peg4000、以及其任何组合。在一些实施例中，表面活性剂包含聚山梨醇酯。在一些情况下，表面活性剂是聚山梨醇酯80。[0076]本文所述的蛋白配制品可以包含一种表面活性剂或表面活性剂的混合物。在一些实施例中，液体配制品(冻干前)包含浓度为约0.001％至约5％w/v(或约0.001％至约0.5％、或约0.004％至约0.5％w/v、或约0.001％至约0.01％w/v或约0.004％至约0.01％w/v)的表面活性剂。在一些实施例中，液体配制品包含浓度为至少0.001％、至少0.002％、至少0.003％、至少0.004％、至少0.005％、至少0.007％、至少0.01％、至少0.05％、至少0.1％、至少0.2％、至少0.3％、至少0.4％、至少0.5％、至少0.6％、至少0.7％、至少0.8％、至少0.9％、至少1.0％、至少1.5％、至少2.0％、至少2.5％、至少3.0％、至少3.5％、至少4.0％、或至少4.5％w/v的表面活性剂。在一些实施例中，液体配制品包含浓度为约0.001％至约0.5％w/v的表面活性剂。在一些实施例中，液体配制品包含浓度为约0.001％至约0.01％w/v的表面活性剂。在一些实施例中，液体配制品包含浓度为约0.001％至约0.01％w/v的表面活性剂。在一些实施例中，液体配制品包含浓度为约0.001％、约0.002％、约0.003％、约0.004％、约0.005％、约0.006％、约0.007％、约0.008％、约0.009％、约0.01％、约0.05％、约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％至约0.5％w/v的表面活性剂。在一些实施例中，液体配制品包含浓度为约0.001％至约0.01％w/v的表面活性剂。在一些实施例中，表面活性剂是聚山梨醇酯80，聚山梨醇酯80以约0.01％w/v的浓度存在。[0077]缓冲液[0078]本披露的蛋白配制品任选地包含缓冲液。合适的缓冲液包括乙酸盐缓冲液、谷氨酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、酒石酸盐缓冲液、富马酸盐缓冲液、马来酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、2-(n-吗啉代)乙磺酸盐缓冲液、或其任何组合。在一些情况下，缓冲液包含谷氨酸。[0079]通常采用缓冲剂来控制配制品中的ph。在一些实施例中，以一定浓度添加缓冲液使液体配制品的ph保持在约3至约7、或约4至约6、约4至5、或约4.2。ph对配制品的影响可以使用几种途径中的任何一种或多种来表征，如加速稳定性研究和量热筛选研究(remmeler.l.jr.,等人,biochemistry[生物化学],38(16):5241-7(1999))。[0080]选择蛋白配制品中存在的缓冲液系统以在生理学上相容并保持所希望的ph。缓冲液可以按约0.1mm和约1000mm(1m)之间、或约5mm和约200mm之间、或约5mm至约100mm之间、或约10mm和约50mm之间的浓度存在于液体配制品(冻干前)中。合适的缓冲液浓度涵盖约200mm或更低的浓度。在一些实施例中，液体蛋白配制品(冻干前)中的缓冲液以约190mm、约180mm、约170mm、约160mm、约150mm、约140mm、约130mm、约120mm、约110mm、约100mm、约80mm、约70mm、约60mm、约50mm、约40mm、约30mm、约20mm、约10mm或约5mm的浓度存在。在一些实施例中，缓冲液的浓度为至少0.1、0.5、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.5、1.7、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、700、或900mm。在一些实施例中，缓冲液的浓度为在1、1.2、1.5、1.7、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、或90mm和100mm之间。在一些实施例中，缓冲液的浓度为在5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、或40mm和50mm之间。在一些实施例中，缓冲液的浓度为约10mm。[0081]在一些实施例中，液体蛋白配制品(冻干前)具有约4.2的ph，并且包含约10mml-谷氨酸、约9.0％(w/v)蔗糖以及约0.01％(w/v)聚山梨醇酯80。[0082]冻干蛋白配制品的稳定性[0083]本文披露的方法有利地产生冻干蛋白配制品，该冻干蛋白配制品在用液体重构后表现出蛋白质的降低的物理降解(如聚集)，以及降低的化学降解(如降低的剪切和脱酰胺化)。用于重构冻干蛋白配制品的液体可以是本领域已知的任何合适的液体。在实施例中，冻干蛋白配制品可以用水重构。此外，本文披露的冻干方法能够稳定低浓度和高浓度蛋白配制品，如含有抗体和双特异性抗体构建体(例如，半衰期延长的双特异性抗体构建体)的配制品。[0084]如含有抗体或双特异性抗体构建体(例如，hle双特异性抗体构建体)的配制品的蛋白配制品的稳定性可以以几种方式进行定量。在一些实施例中，蛋白配制品的稳定性通过尺寸排阻高效液相色谱(se-hplc)、尺寸排阻超高效液相色谱(se-uhplc)、阳离子交换高效液相色谱(ce-hplc)、动态光散射(dls)、分析超离心(auc)、场流分离(fff)、等电聚焦以及离子交换色谱(iex)来表征。在一些实施例中，蛋白配制品(如抗体配制品)的稳定性通过部分解离来表征，如通过十二烷基硫酸钠的毛细管电泳(ce-sds)和/或十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)测量的。在一些实施例中，配制品的稳定性通过还原型毛细管电泳-十二烷基硫酸钠(rce-sds)评估。rce-sds方法在还原条件下分离出重链(hc)、轻链(lc)、非糖基化的hc(nghc)和其他次要的峰物质和基团。[0085]在一些实施例中，配制品的稳定性通过在不同时间点的储存条件后蛋白质如抗体或双特异性抗体构建体(例如，hle双特异性抗体构建体)的高分子量(hmw)物质的量来表征，或通过蛋白质的hmw物质的量的增加速率来表征。在一些实施例中，在重构后在大约4℃或40℃下储存一周、两周、一个月、三个月、六个月或十二个月后确定蛋白质的hmw物质的量。在一些实施例中，在重构后在大约4℃或40℃下储存一周、两周、一个月、三个月、六个月或十二个月后确定蛋白质的hmw物质的增加速率。在一些实施例中，通过se-uhplc来测量重构冻干配制品中的蛋白质，如抗体或双特异性抗体构建体(例如，hle双特异性抗体构建体)的hmw物质。[0086]蛋白质(如抗体或双特异性抗体构建体(例如，hle双特异性抗体构建体))的稳定性和配制品保持蛋白质的稳定性的能力，可以在延长的时间段(例如，数周或数月)内评估。在配制品的上下文中，稳定的配制品是其中的蛋白质如抗体或双特异性抗体构建体(例如，hle双特异性抗体构建体)在储存后和加工过程(例如冷冻/解冻、机械混合和冻干)中基本上保持其物理和/或化学完整性和/或生物活性的配制品。例如，可以通过测量高分子量(hmw)聚集体形成、电荷特征的改变以及颗粒大小的变化的水平和/或速率来评估蛋白质稳定性。[0087]在一些实施例中，蛋白质的任何特定物质，如完整分子或主要物质、或高分子量(hmw)物质(即，聚集体)、或低分子量(lmw)物质(即，片段)的相对值是相对于总产物的各自的值来表示的。例如，在一些实施例中，2.5％或更少(例如，2.5％、或2％、或1.9％、或1.8％、或1.7％、或1.6％、或1.5％、或1.4％、或1.3％、或1.2％、或1.1％、或1％、或0.5％)的蛋白质(如抗体或双特异性抗体构建体)，在重构冻干配制品中作为hmw物质存在。在一些实施例中，在4℃下储存一个月或更久(例如，持续一个月、持续三个月、或持续六个月)后，hmw物质的量在重构冻干配制品中增加少于1％(例如，0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％)。在一些实施例中，在4℃下储存一个月或更久(例如，持续一个月、持续三个月、或持续六个月)后，hmw物质的量在重构冻干配制品中增加大约0.1％和0.4％(例如，0.1％、0.2％、0.3％、或0.4％)之间。在一些实施例中，在40℃下储存一周或更久(例如，持续一周、持续两周、持续一个月或持续三个月)后，hmw物质的量在重构冻干配制品中增加小于1％(例如，0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％)。在一些实施例中，在40℃下储存一周或更久(例如，持续一周、持续两周、持续一个月或持续三个月)后，hmw物质的量在重构冻干配制品中增加小于0.5％(例如，0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％)。在一些实施例中，在40℃下储存一个月或更久(例如，持续一个月、持续三个月、持续六个月、持续九个月、或持续十二个月)后，hmw物质的量在重构冻干配制品中增加小于0.5％(例如，0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％)。在一些实施例中，在40℃下储存一个月后，hmw物质的量在重构冻干配制品中增加小于0.5％。在一些实施例中，在40℃下储存一个月后，hmw物质的量在重构冻干配制品中增加小于0.3％。在一些实施例中，在40℃下储存一周或更久(例如，持续一周、持续两周、持续一个月、或持续三个月)后，hmw物质的量在重构冻干配制品中增加大约0.1％和0.7％(例如，0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、或0.7％)之间。在一些实施例中，在40℃下储存一周或更久(例如，持续一周、持续两周、持续一个月、或持续三个月)后，hmw物质的量在重构冻干配制品中增加大约0.1％和0.5％(例如，0.1％、0.2％、0.3％、0.4％以及0.5％)之间。在一些实施例中，在40℃下储存一个月或更久(例如，持续一个月、持续三个月、持续六个月、持续九个月或持续十二个月)后，hmw物质的量在重构冻干配制品中增加大约0.1％和0.5％(例如，0.1％、0.2％、0.3％、0.4％以及0.5％)之间。在一些实施例中，通过se-uhplc来测量重构冻干配制品中的双特异性抗体构建体的hmw物质。[0088]在一些实施例中，配制品的稳定性的通过在不同时间点的储存条件下蛋白质如抗体或双特异性抗体构建体(hle双特异性抗体构建体)的低分子量(lmw)物质的量来表征，或通过蛋白质的lmw物质的量的增加速率来表征。在一些实施例中，在大约4℃或40℃下储存一周、两周、一个月、三个月、六个月或十二个月时确定lmw物质的量。在一些实施例中，在大约4℃或40℃下储存一周、两周、一个月、三个月、六个月或十二个月时确定lmw物质的增加速率。在一些实施例中，通过还原型毛细管电泳-十二烷基硫酸钠(rce-sds)来测量配制品中的蛋白质，如抗体或双特异性抗体构建体(hle双特异性抗体构建体)的lmw物质。在一些实施例中，通过尺寸排阻色谱(sec)来测量配制品中的双特异性抗体构建体的lmw物质。[0089]在一些实施例中，少于2％(例如，1.9％、1.8％、1.7％、1.6％、1.5％、1.4％、1.3％、1.2％、1.1％、1％、或0.5％)的蛋白质，如抗体或双特异性抗体构建体(hle双特异性抗体构建体)，在重构冻干配制品中作为低分子量(lmw)物质存在。在一些实施例中，在4℃下储存一个月或更久(例如，持续一个月、持续三个月、或持续六个月)后，lmw物质的量在重构冻干配制品中增加少于2％(例如，1.9％、1.8％、1.7％、1.6％、1.5％、1.4％、1.3％、1.2％、1.1％、1％、或0.5％)。在一些实施例中，在4℃下储存一个月或更久(例如，持续一个月、持续三个月、或持续六个月)后，lmw物质的量在重构冻干配制品中增加大约0.1％和0.7％(例如，0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％或0.7％)之间。在一些实施例中，在40℃下储存一周或更久(例如，持续一周、持续两周、持续一个月或持续三个月)后，lmw物质的量在重构冻干配制品中增加小于1％(例如，0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％)。在一些实施例中，在40℃下储存一周或更久(例如，持续一周、持续两周、持续一个月、或持续三个月)后，lmw物质的量在重构冻干配制品中增加大约0.1％和0.7％(例如，0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％或0.7％)之间。在一些实施例中，通过尺寸排阻色谱(sec)来测量重构冻干配制品中的双特异性抗体构建体的lmw物质。在一些实施例中，通过还原型毛细管电泳-十二烷基硫酸钠(rce-sds)来测量重构冻干配制品中的双特异性抗体构建体的lmw物质。[0090]在一些实施例中，蛋白质如抗体或双特异性抗体构建体(hle双特异性抗体构建体)(即，主峰物质)在重构冻干配制品中的百分比大于配制品中总蛋白质含量的95％。[0091]在一些实施例中，配制品在约4℃下储存一个月后是稳定的，并且当储存至少一个月时，hmw物质的量在重构冻干配制品中增加大约0.1％至0.7％(例如，0.1％、或0.2％、或0.3％、或0.4％、或0.5％、或0.6％、或0.7％)之间。在一些实施例中，配制品在约4℃下储存三个月后是稳定的，并且当储存至少三个月时，hmw物质的量在重构冻干配制品中增加大约0.0％至0.2％(例如，0％、或0.1％、或0.2％)之间。在一些实施例中，配制品在约4℃下储存六个月后是稳定的，并且当储存至少六个月时，hmw物质的量在重构冻干配制品中增加大约0.0％至0.4％(例如，0％、或0.1％、或0.2％、或0.3％、或0.4％)之间。在一些实施例中，通过se-uhplc来测量重构冻干配制品中的双特异性抗体构建体的hmw物质。[0092]在一些实施例中，配制品在约4℃下储存一个月、三个月以及六个月后是稳定的，并且蛋白质，如抗体或双特异性抗体构建体(hle双特异性抗体构建体)的百分比高于总蛋白质含量的95％。在一些实施例中，配制品在约4℃下储存一个月、三个月、六个月、十二个月以及48个月后是稳定的，并且重构后蛋白质，如抗体或双特异性抗体构建体(hle双特异性抗体构建体)的百分比高于总蛋白质含量的96％。[0093]本文所述配制品的稳定性还可以通过电荷分布，例如蛋白质，如抗体或双特异性抗体构建体(hle双特异性抗体构建体)的电荷变体峰的量的变化来表征。例如，在一些实施例中，当在4℃下储存至少一个月(例如，持续一个月、三个月、六个月或十二个月)时，重构冻干配制品中的酸性峰(例如，脱酰胺化，具有相对较低的等电点(pi)的电荷变体)的量增加少于2％(例如，2％、1.9％、1.8％、1.7％、1.6％、1.5％、1.4％、1.3％、1.2％、1.1％、1.0％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、或更少)。在一些实施例中，当在4℃下储存至少一个月(例如，持续一个月、三个月、六个月或十二个月)时，重构冻干配制品中的碱性峰(例如，具有相对较高的pi的电荷变体)的量增加小于6％(例如，6％、5％、4％、3％、2％或1％)。在一些实施例中，当在4℃下储存至少一个月时，重构冻干配制品中的主峰的量降低少于4％(例如，4％、3.5％、3％、2.5％、2％、1％或更少)。在一些实施例中，当在4℃下储存至少三个月时，重构冻干配制品中的主峰的量降低小于6％(例如，6％、5％、4％、3.5％、3％、2.5％、2％或更少)。在一些实施例中，当在4℃下储存至少六个月时，重构冻干配制品中的主峰的量降低少于9％(例如，9％、8％、7％、6％、5％、4％、3.5％、3％、2.5％、2％或更少)。在一些实施例中，当在4℃下储存至少十二个月时，重构冻干配制品中的主峰的量降低少于9％(例如，9％、8％、7％、6％、5％、4％、3.5％、3％、2.5％、2％或更少)。[0094]在一些实施例中，当在40℃下储存至少一周(例如，持续一周、两周、一个月或三个月)时，重构冻干配制品中的酸性峰的量增加少于30％(例如，30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、4％、4％、3％、2％、1％或更少)。在一些实施例中，当在40℃下储存至少一周(例如，持续一周、两周、一个月或三个月)时，重构冻干配制品中的碱性峰(例如，具有相对较高的pi的电荷变体)的量增加少于15％(例如，15％、10％、9％、8％、7％、6％、4％、4％、3％、2％、1％或更少)。在一些实施例中，当在4℃下储存至少一个月时，重构配制品中的主峰的量降低少于4％(例如，4％、3.5％、3％、2.5％、2％、1％或更少)。在一些实施例中，当在4℃下储存至少三个月时，重构冻干配制品中的主峰的量降低少于6％(例如，6％、5％、4％、3.5％、3％、2.5％、2％或更少)。[0095]与可比较的液体蛋白配制品相比，通过本披露的方法冻干的蛋白配制品表现出更优越的稳定性。例如，对根据本披露使用退火步骤冻干并且然后重构的蛋白配制品(含有1mg/ml的本披露的双特异性抗体构建体、10mml-谷氨酸、9％(w/v)蔗糖、以及0.01％(w/v)聚山梨醇酯80，ph4.2)的稳定性进行具有十二烷基硫酸钠的还原型毛细管电泳(rce-sds)以确定在25℃和在40℃下储存一个月后的剪切程度。参见实例3。如图1和2中所示，重构冻干配制品在两个温度下表现出比液体配制品显著更少的剪切，证明了根据本文所述的方法冻干的蛋白配制品具有比可比较的液体配制品更优越的稳定性。[0096]本披露的冻干方法还有利地稳定低浓度和高浓度的蛋白配制品。例如，使用退火步骤冻干并且然后重构的本披露的蛋白配制品(含有1mg/ml、5mg/ml、13mg/ml以及23mg/ml的本披露的双特异性抗体构建体、10mml-谷氨酸、9％(w/v)蔗糖、以及0.01％(w/v)聚山梨醇酯80，ph4.2)在40℃下储存一个月后进行sec-uhplc以通过高分子量物质的百分比(％hmw)确定在配制品中的聚集程度。参见实例4。如图3中所示，在加速应力条件下没有发生％hmw的增加，证明了本文披露的冻干方法能够稳定具有低浓度和高浓度蛋白质(如双特异性抗体构建体)两者的配制品。[0097]令人惊讶地发现，与包括退火步骤的冻干方法相比，缺少退火步骤的本披露的冻干方法导致蛋白配制品的更优越的稳定性。例如，使用和不使用退火步骤进行冻干的蛋白配制品(含有15mg/ml、20mg/ml、或23mg/ml的本披露双特异性抗体构建体、10mml-谷氨酸、9％(w/v)蔗糖、以及0.01％(w/v)聚山梨醇酯80，ph4.2)在重构后进行se-uhplc以确定每个样品中的聚集量。参见实例5。如表1、表2、图4和图5中所示，通过更高的％hmw证明，已经退火的样品比未退火的样品或对照样品表现出显著更多的聚集。[0098]提供以下实例用于说明而不旨在限制本发明的范围。[0099]实例[0100]通用程序[0101]具有十二烷基硫酸钠的还原型毛细管电泳(rce-sds)基于蛋白质在还原和变性条件下的流体动力学大小差异来分离蛋白质。蛋白质物质与sds(阴离子洗涤剂)结合，并通过电动力学注射到填充有sds凝胶缓冲液的裸露熔融石英毛细管中。在毛细管上施加电压，在此电压下，sds包被的蛋白质由于在基于亲水聚合物的溶液中的迁移不同而被分离。蛋白质通过uv检测窗口时，通过光电二极管阵列(pda)检测器检测。通过确定每种组分的校正峰面积百分比来评估纯度。rce-sds方法在还原条件下分离出重链(hc)、轻链(lc)、非糖基化的hc(nghc)和其他次要的峰物质和基团。通过在79℃下在sds-mw还原凝胶中孵育样品10分钟，进行具有十二烷基硫酸钠的还原型毛细管电泳(rce-sds)。孵育后，将样品离心，并且然后使用电动力学注射将样品电动力学注射至具有50μm内径的67-cm裸露熔融石英毛细管。毛细管的有效长度为30.2cm。使用ce-sds凝胶(贝克曼库尔特公司(beckmancoulter)，贝瑞阿，加利福尼亚州)和30kv有效电压进行分离。通过uv吸光度在220nm下进行检测。[0102]尺寸排阻超高效液相色谱(se-uhplc).sec-uhplc基于蛋白质流体动力学体积的差异分离蛋白质。具有较高流体动力学体积的分子比具有较小体积的分子更先洗脱。将样品加载到se-uhplc柱(beh200，4.6x300mm，(沃特斯公司(waterscorporation)，186005226))上，等度分离并通过uv吸光度监测洗脱液。通过计算每个分离的组分与总积分面积相比的百分比来确定纯度。se-uhplc设置如下：流速：0.4ml/min，运行时间：12min，uv检测：280nm，柱温度：环境，靶蛋白质加载：6μg，蛋白质相容的流动池：5mm。[0103]蛋白配制品.制备蛋白配制品，其包含浓度为1mg/ml、5mg/ml、13mg/ml、或23mg/ml的完整双特异性抗体构建体，10mml-谷氨酸、9％(w/v)蔗糖、0.01％(w/v)聚山梨醇酯80，ph4.2。将蛋白配制品引入小瓶中用于冻干(使用或不使用退火步骤)。[0104]实例1[0105]使用退火步骤的双特异性抗体构建体配制品的冻干[0106]如上所述制备液体蛋白配制品，并且引入冻干室。以0.5℃/min的速率将室从环境温度冷却至-45℃，并且在-45℃下保持2小时。冻干室的压力从环境降低至70毫托，以0.33℃/min的速率将室加热至-25℃，并且在70毫托的压力下在-25℃下保持52小时。然后以0.1℃/min的速率将室加热至30℃，并在70毫托下在30℃下保持8小时。为了能够塞住小瓶，将室的温度降低至5℃，并且在500毫托下用氮气对室充气。从冻干室移除含有冻干蛋白配制品的小瓶，并且在2-8℃下储存直至进一步处理和分析。[0107]用注射用水重构冻干蛋白配制品。[0108]实例2[0109]不使用退火步骤的双特异性抗体构建体配制品的冻干[0110]如上所述制备液体蛋白配制品，并且引入冻干室。以0.5℃/min的速率将室从环境温度冷却至-45℃，并且在-45℃下保持2小时。以0.5℃/min的速率将室的温度升高至-12℃，并在-12℃下保持5小时。然后以0.5℃/min的速率将室冷却至-45℃，并在-45℃下保持2小时。室的压力从环境降低至70毫托，以0.33℃/min的速率将室加热至-25℃，并且在70毫托的压力下在-25℃下保持52小时。然后以0.1℃/min的速率将室加热至30℃，并在70毫托下在30℃下保持8小时。为了能够塞住小瓶，将室的温度降低至5℃，并且在500毫托下用氮气对冻干室充气。从冻干室移除含有冻干蛋白配制品的小瓶，并且在2-8℃下储存直至进一步处理和分析。[0111]用注射用水重构冻干蛋白配制品。[0112]实例3[0113]使用rce-sds的双特异性抗体构建体的液体配制品和冻干配制品的稳定性比较[0114]如上所述制备含有1mg/mlbitea、biteb、bitec或bited的液体配制品和冻干配制品(使用退火步骤制备)。将蛋白质浓度为1mg/ml的液体配制品和重构冻干(用注射用水重构)配制品进行具有十二烷基硫酸钠的还原型毛细管电泳(rce-sds)以确定在25℃下储存一个月之后发生的剪切程度。如图1中所示，如通过较低的低分子量物质百分比(lms％)所证明，所有重构冻干配制品都证明了比液体配制品显著更少的剪切，这表明重构冻干配制品具有比液体配制品更优越的稳定性。进一步地，将含有1mg/mlbiteb的液体配制品和重构冻干配制品进行rce-sds以确定在40℃下储存一个月之后发生的剪切程度。如图2中所示，如通过较低的lms％所证明，重构冻干配制品证明了比液体配制品显著更少的剪切，这表明冻干配制品(使用退火步骤制备)甚至在更高的温度下也具有比液体配制品更优越的稳定性。[0115]实例4[0116]冻干配制品稳定性的浓度影响(使用se-uhplc)[0117]具有不同浓度的biteb(1mg/ml、5mg/ml、13mg/ml、和23mg/ml)的冻干配制品(使用退火步骤制备)在40℃下储存一个月后在重构后进行sec-uhplc以确定配制品中的聚集程度，其通过高分子量物质百分比(％hmw)来确定。如图3中所示，在加速应力条件下％hmw没有增加，证明了冻干周期能够稳定具有低浓度和高浓度双特异性抗体构建体的配制品。[0118]实例5[0119]使用se-uhplc的双特异性抗体构建体的退火和非退火冻干配制品的稳定性比较[0120]使用se-uhplc确定含有23mg/mlbiteb的冻干配制品的退火(根据实例1制备)和非退火(根据实例2制备)样品在冷冻温度下储存后的聚集量。退火样品储存如下：在45℃下储存48小时，在-12℃下储存5小时，在-45℃下储存5小时，并且在-25℃下储存48小时。将非退火样品在-46℃下储存58小时，然后在-25℃下储存48小时。如图4中所示，通过更高的％hmw证明，退火样品在重构后表现出比非退火样品重构后或对照样品(含有10mm谷氨酸、9％(w/v)蔗糖、0.01％(w/v)聚山梨醇酯80(具有-10℃的干燥温度))显著更多的聚集。参见图5。[0121]冻干发生之前和之后，使用se-uhplc确定含有15mg/mlbiteb的冻干配制品的退火(根据实例1制备)和非退火(根据实例2制备)样品中的聚集量。如下表1中所示，如通过更高的％hmw所证明，相比在冻干过程期间未退火的样品重构后，在冻干过程期间已经退火的配制品在重构后表现出显著更多的聚集。[0122]表1.[0123][0124]冻干发生之前和之后，使用se-uhplc确定含有20mg/mlbitea、bitec、或bitee(具有seqidno:122中列出的序列的双特异性抗体构建体)的冻干配制品的退火(根据实例1制备)和非退火(根据实例2制备)样品中的聚集量。如下表2中所示，如通过更高的％hmw所证明，在冻干过程期间已经退火的重构配制品表现出比在冻干过程期间未退火的重构样品显著更多的聚集的。[0125]表2[0126][0127][0128]提供以上描述仅为了清楚理解，而不应理解为无必要的限制，因为本发明范畴内的修改方案对本领域普通技术人员是显而易见的。[0129]贯穿本说明书及其后的权利要求书，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”以及变型如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”应当被理解成隐含包括所述整数或步骤或者整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤的组。[0130]应理解，当描述值范围时，所描述的特征可以是在该范围内找到的单个值。例如，“从约ph4至约ph6的ph”可以是但不限于，ph4、4.2、4.6、5.1、5.5等，以及这些值之间的任何值。另外，“从约ph4至约ph6的ph”不应被解释为意指所考虑配制品的ph在储存期间在ph4至ph6的范围内变化2个ph单位，而是指溶液的ph可以在该范围内挑选值，并且ph在约该ph下保持缓冲。[0131]当使用术语“约”时，其意指所列举数字加上或减去所列举数字的5％、10％、15％或更多。预期的实际变化可从上下文确定。[0132]贯穿本说明书，在组合物描述为包括组分或材料时，除非另外描述否则预期这些组合物也可基本上由或由所叙述的组分或材料的任何组合组成。同样，在方法描述为包括特定步骤时，除非另外描述，否则预期这些方法也可基本上由或由所叙述的步骤的任何组合组成。本文中说明性地披露的本发明可在不存在本文中未明确披露的任何要素或步骤的情况下适当地实践。[0133]本文中所披露的方法及其单个步骤的实践可人工和/或在电子设备辅助或由其提供的自动化下进行。虽然已参考特定实施例描述了诸多方法，但本领域普通技术人员应容易了解到，可使用执行与这些方法相关的动作的其他方式。例如，除非另外描述，否则可在不背离该方法的范畴或精神的情况下改变各步骤的顺序。此外，一些单个步骤可组合、省略或进一步再分成另外的步骤。[0134]本文中所引用的所有专利、出版物及参考文献均通过引用以其全文并入本文中。在本披露与所并入的专利、出版物及参考文献出现矛盾的情况下，应以本披露为主。当前第1页12当前第1页12