该技术已申请专利。仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。 免疫原性组合物及其用途1.序列表2.本技术包含序列表，该序列表已以ascii格式电子提交，并通过援引以其全文并入本文。于2021年9月2日创建的所述ascii副本命名为51509-045wo2_sequence_listing_9_2_21_st25且大小为52,787字节。3.背景4.疫苗接种对人类和动物健康都做出了巨大贡献。自1796年发明第一款疫苗以来，疫苗已被认为是通过在受试者中激发免疫反应来预防多种传染病最成功的方法。根据世界卫生组织的资料，免疫接种目前每年预防所有年龄段2-3百万例死亡。如今，已开发出疫苗来预防和控制包括白喉、破伤风、百日咳、流感和麻疹在内的超过20种传染病的传播，并已使得天花被完全根除。仍然需要开发新的和改良的免疫原性组合物及其用途。5.概述6.本披露提供了编码一种或多种免疫原的多核糖核苷酸(例如，环状或线性多核糖核苷酸)的组合物、药物制剂和用途。特别地，本披露提供了编码多种免疫原的环状多核糖核苷酸，编码至少一种免疫原并进一步编码至少一种佐剂的环状多核糖核苷酸，以及包含多种环状多核糖核苷酸的组合物。本披露进一步涉及使用编码一种或多种多肽免疫原的环状多核糖核苷酸的方法。本文所述的环状多核糖核苷酸的组合物和药物制剂在施用后可在受试者中诱导免疫反应。本文所述的环状多核糖核苷酸的组合物和药物制剂可用于治疗或预防受试者的疾病、病症或病状。7.在一方面，本文提供了包含多个序列的环状多核糖核苷酸，每个序列编码多肽免疫原，其中这些多肽免疫原中的至少两种(例如，至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种和至少九种)具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％)的氨基酸序列同一性。在一些实施例中，该至少两种多肽免疫原具有至少95％(例如，96％、至少97％、至少98％和至少99％)的氨基酸序列同一性。在一些实施例中，该至少两种多肽免疫原具有小于100％的氨基酸序列同一性。在一些实施例中，这些多肽免疫原中的每一种具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％)的氨基酸序列同一性。在一些实施例中，这些多肽免疫原中的每一种具有至少95％(例如，96％、至少97％、至少98％和至少99％)的氨基酸序列同一性。在一些实施例中，这些多肽免疫原中的每一种具有小于100％的氨基酸序列同一性。8.在一些实施例中，这些多肽免疫原中的每一种包括一个或多个鉴别靶标的表位。在一些实施例中，该靶标是病原体。在一些实施例中，该病原体是病毒、细菌、真菌或寄生虫。在一些实施例中，病原体是病毒并且每种多肽免疫原包括对应于病毒免疫原的一个或多个表位(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)。在一些实施例中，病原体是细菌并且每种多肽免疫原包括对应于细菌免疫原的一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)表位。在一些实施例中，该靶标是癌细胞。在一些实施例中，多肽免疫原包括对应于肿瘤抗原的一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个和十个或更多个)表位。在一些实施例中，该靶标是毒素或过敏原。在一些实施例中，该靶标与疾病、病症或病状相关。在一些实施例中，该疾病、病症或病状是病毒感染。在一些实施例中，该疾病、病症或病状是细菌感染。在一些实施例中，该疾病、病症或病状是癌症。9.在另一方面，本披露提供了一种环状多核糖核苷酸，该环状多核糖核苷酸包括多个序列，每个序列编码多肽免疫原，其中这些多肽免疫原中的至少两种(例如，至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种或至少九种)鉴别不同的蛋白质，其中这些不同的蛋白质中的每一种鉴别相同的靶标。10.在一些实施例中，这些多肽免疫原中的每一种鉴别不同的蛋白质。在一些实施例中，该靶标是病原体。在一些实施例中，该病原体是病毒、细菌、真菌或寄生虫。在一些实施例中，该病原体是病毒并且这些不同的蛋白质中的每一种是与该病毒相关的病毒蛋白质。在一些实施例中，该病原体是细菌并且这些不同的蛋白质中的每一种是与该细菌相关的细菌蛋白质。在一些实施例中，该靶标是癌细胞。在一些实施例中，这些不同的蛋白质中的每一种是与该癌细胞相关的不同肿瘤抗原。在一些实施例中，该靶标是过敏原或毒素。11.在另一方面，本披露提供了一种环状多核糖核苷酸，该环状多核糖核苷酸包括多个序列，每个序列编码多肽免疫原，其中这些多肽免疫原中的至少两种(例如，至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种或至少九种)鉴别不同的靶标。在一些实施例中，这些多肽免疫原中的每一种鉴别不同的靶标。在一些实施例中，每个靶标是不同的病原体。在一些实施例中，每个靶标独立地是癌细胞、病毒、细菌、真菌或寄生虫。在一些实施例中，每个靶标是不同的病毒。在一些实施例中，每个靶标是不同的细菌。在一些实施例中，这些靶标包括病毒和细菌。12.在本文所述的任一种环状多核糖核苷酸的一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括500至20,000个核糖核苷酸(例如500至10,000、500至9,000、500至8,000、500至5,000、500至4,000、500至3,000、1000和10,000、1,000和8,000、1,000至5,000、3,000至8,000、4,000至9,000或10,000至20,000个))。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括500至5,000个。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括1,000至5,000个核糖核苷酸。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括5,000至10,000个核糖核苷酸。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括至少500个核糖核苷酸(例如至少600、至少1000、至少1500、至少2000、至少2500、至少3000、至少3500、至少4000、至少4500、至少5000、至少5500、至少6000、至少6500、至少7000、至少7500、至少8000、至少8500、至少9000或至少9500个核糖核苷酸)。13.在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个或至少九个序列，每个序列编码多肽免疫原。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括两个或三个、两个至五个(例如，两个、三个或四个)、或五个至十个序列(例如，五个、六个、七个、八个、九个或多个序列)，每个序列编码多肽免疫原。14.在一些实施例中，至少一个编码多肽免疫原的序列进一步编码信号序列。在一些实施例中，每个编码多肽免疫原的序列进一步编码信号序列。在一些实施例中，编码这些多肽免疫原中的每一种的每一个序列与内部核糖体进入位点(ires)可操作地连接。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括单个ires。在一些实施例中，这些多肽免疫原中的每一种由与该单个ires可操作地连接的单个开放阅读框编码，其中该开放阅读框的表达产生包括这些多肽免疫原中的每一种的氨基酸序列的多肽。15.在一些实施例中，这些多肽免疫原各自被多肽接头隔开。在一些实施例中，这些多肽免疫原各自被裂解结构域隔开。在一些实施例中，每个交错元件均为2a自裂解肽。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括多个ires。在一些实施例中，每个ires与包括编码多肽免疫原的序列的开放阅读框可操作地连接。16.在一些实施例中，环状多核糖核苷酸进一步包括编码佐剂的至少一个序列(例如，至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个和至少十个序列)。在一些实施例中，编码该佐剂的该至少一个序列(例如，至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个和至少十个序列)与ires可操作地连接。17.在另一方面，本披露提供了一种环状多核糖核苷酸，该环状多核糖核苷酸包含编码多肽免疫原的序列和编码佐剂的序列或作为先天性免疫系统刺激剂的序列。在一些实施例中，编码该多肽免疫原的该序列与ires可操作地连接。在一些实施例中，编码该佐剂的该序列与ires可操作地连接。在一些实施例中，该多肽免疫原和该佐剂多肽由与该单个ires可操作地连接的单个开放阅读框编码，其中该开放阅读框的表达产生包括该多肽免疫原和该佐剂多肽中的每一种的氨基酸序列的多肽。在一些实施例中，该多肽免疫原和该佐剂多肽各自被多肽接头隔开。在一些实施例中，该多肽免疫原和该佐剂多肽各自被裂解结构域隔开。在一些实施例中，每个交错元件均为2a自裂解肽。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括多个ires。在一些实施例中，第一ires与编码该多肽免疫原的该序列可操作地连接并且第二ires与编码该佐剂多肽的该序列可操作地连接。18.在一些实施例中，其中环状多核糖核苷酸编码至少一种多肽免疫原和至少一种佐剂(例如，多肽佐剂)，编码多肽免疫原的序列的表达是编码佐剂的序列的表达的至少2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍。在一些实施例中，编码多肽免疫原的序列的表达与编码佐剂的序列的表达基本上相同。19.在另一方面，本披露提供了一种包含多种环状多核糖核苷酸的组合物，其中该组合物包含：包含编码多肽免疫原的序列的至少第一环状多核糖核苷酸，和包含编码佐剂的序列或作为先天性免疫系统刺激剂的序列的至少第二环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，该多肽免疫原和该佐剂各自与ires可操作地连接。20.在一些实施例中，该佐剂是多肽。在一些实施例中，佐剂是细胞因子、趋化因子、共刺激分子、先天性免疫刺激剂、信号传导分子、转录激活因子、细胞因子受体、细菌组分或先天性免疫系统的组分。在一些实施例中，该细胞因子是促炎性细胞因子。在一些实施例中，该促炎性细胞因子选自gm-csf、il-1α、il-1β、tgf-β、tnf-α和tnf-β。在一些实施例中，该细胞因子是th-1诱导性细胞因子。在一些实施例中，该th-1诱导性细胞因子选自ifn-γ、il-2、il-12、il-15和il-18。在一些实施例中，该细胞因子是th-2诱导性细胞因子。在一些实施例中，该th-2诱导性细胞因子选自ifn-γ、il-4、il-5、il-6、il-10和il-13。在一些实施例中，该趋化因子选自mcp-1、mip-1α、mip-1β、rantes和tca-3。在一些实施例中，该共刺激分子选自cd80、cd86、cd40-l、cd70和cd27。在一些实施例中，先天性免疫刺激剂选自sting(例如，组成型活性sting，诸如stingv155m、stingr284m、stingr284m/v147l/n154s/v155m或stingv147l/n154s/v155m)、tlr3、tlr4、tlr9、tlr7、tlr8、tlr7、rig-i/ddx58和mda-5/ifih1。在一些实施例中，该先天性免疫刺激剂是组成型活性突变体。在一些实施例中，该信号传导分子选自sting(例如组成型活性sting，诸如stingv155m、stingr284m、stingr284m/v147l/n154s/v155m或stingv147l/n154s/v155m)、trif、tram、myd88、ips1、asc、mavs、mapk、ikk-α、ikk复合物、tbk1、b-连环蛋白和半胱天冬酶1。在一些实施例中，该转录激活因子选自ap1、nf-κb、irf3、irf7、irf1和irf5。在一些实施例中，该细胞因子受体选自il-2βr、ifn-γr和il-6r。在一些实施例中，该细菌组分选自鞭毛蛋白和mbl。21.在本文所述的环状多核糖核苷酸中的任何一种的一些实施例中，至少一个编码佐剂的序列进一步编码信号序列。在一些实施例中，每个编码免疫原的序列进一步编码信号序列。在一些实施例中，至少一个编码免疫原的序列不编码信号序列。在一些实施例中，编码免疫原的序列均未进一步编码信号序列。22.在一些实施例中，该环状多核糖核苷酸进一步包括作为先天性免疫系统刺激剂的序列。在一些实施例中，作为先天性免疫系统刺激剂的该序列是富含gu的基序、富含au的基序、包含dsrna的结构化区域、或适体。23.在本文所述的任一种环状多核糖核苷酸的一些实施例中，其中该环状多核糖核苷酸包括具有5'末端和3'末端的第一多核糖核苷酸，其中5'末端和3'末端各自与第二多核苷酸杂交，由此连接第一多核糖核苷酸的5'末端和3'末端以形成环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸通过夹板连接产生。在一些实施例中，通过提供具有3'末端和5'末端的线性多核糖核苷酸来产生环状多核糖核苷酸，其中3'末端和5'末端各自包括内含子的一部分，并且其中3'末端的内含子部分和5'末端的内含子部分催化剪接反应，从而使5'末端和3'末端共价缀合以产生环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，内含子是i类自剪接内含子。24.在另一方面，本披露提供了包含多个环状多核糖核苷酸的组合物，每个环状多核糖核苷酸均包括编码多肽免疫原的序列。在一些实施例中，该多个环状多核糖核苷酸中的每一个均为本文所述的环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，该组合物包含至少第一环状多核糖核苷酸和至少第二环状多核糖核苷酸，该第一环状多核糖核苷酸包括编码第一多肽免疫原的序列，该第二环状多核糖核苷酸包括编码第二多肽免疫原的序列，其中该第一多肽免疫原和第二多肽免疫原具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％)的氨基酸序列同一性。在一些实施例中，第一多肽免疫原和第二多肽免疫原具有至少95％(至少96％、至少97％、至少98％和至少99％)的氨基酸序列同一性。在一些实施例中，第一多肽免疫原和第二多肽免疫原具有小于100％的氨基酸序列同一性。在一些实施例中，这些多肽免疫原中的每一种包括一个或多个鉴别靶标的表位。在一些实施例中，该组合物包含：包括编码第一多肽免疫原的序列的至少第一环状多核糖核苷酸和包括编码第二多肽免疫原的序列的至少第二环状多核糖核苷酸，其中该第一多肽免疫原和第二多肽免疫原鉴别不同的蛋白质，其中每种不同的蛋白质鉴别相同的靶标。在一些实施例中，该组合物包含：包括编码第一多肽免疫原的序列的至少第一环状多核糖核苷酸和包括编码第二多肽免疫原的序列的至少第二环状多核糖核苷酸，其中该第一多肽免疫原鉴别第一靶标而该第二多肽免疫原鉴别第二靶标。在一些实施例中，每个靶标独立地是癌细胞、病毒、细菌、真菌、寄生虫、毒素或过敏原。在一些实施例中，该靶标是病原体。在一些实施例中，该病原体是病毒、细菌、真菌或寄生虫。在一些实施例中，该靶标是癌细胞、过敏原或毒素。在一些实施例中，每种多肽免疫原均与ires可操作地连接。25.在另一方面，本披露提供了一种环状多核糖核苷酸的药物制剂，其中该环状多核糖核苷酸包含编码多肽免疫原的序列，并且其中该环状多核糖核苷酸占药物制剂中总核糖核苷酸分子的至少25％(w/w)(例如，至少30％(w/w)、40％(w/w)、50％(w/w)、60％(w/w)、70％(w/w)、75％(w/w)、80％(w/w)、85％(w/w)、90％(w/w)、91％(w/w)、92％(w/w)、93％(w/w)、94％(w/w)、95％(w/w)、96％(w/w)、97％(w/w)、98％(w/w)或99％(w/w))。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸占药物制剂中总核糖核苷酸分子的至少70％(w/w)、75％(w/w)、80％(w/w)、85％(w/w)、90％(w/w)、91％(w/w)、92％(w/w)、93％(w/w)、94％(w/w)、95％(w/w)、96％(w/w)、97％(w/w)、98％(w/w)或99％(w/w)。在一些实施例中，该药物制剂包含不超过该药物制剂中总核糖核苷酸分子的75％(w/w)、60％(w/w)、50％(w/w)、40％(w/w)、30％(w/w)、20％(w/w)、15％(w/w)、10％(w/w)、5％(w/w)或1％(w/w)的线性多核糖核苷酸分子。在一些实施例中，该药物制剂包含不超过该药物制剂中总核糖核苷酸分子的0.5％(w/w)(例如，0.4％(w/w)、0.3％(w/w)、0.2％(w/w)、0.1(w/w)和0.05％(w/w)的线性多核糖核苷酸分子。在一些实施例中，该药物制剂包含至少1％(w/w)的线性多核糖核苷酸。在一些实施例中，该药物制剂包含30％-40％(w/w)的环状多核糖核苷酸和1％-10％(w/w)、10％-20％(w/w)、20％-30％(w/w)、30％-40％(w/w)、40％-50％(w/w)、50％-60％(w/w)或60％-70％(w/w)的线性多核糖核苷酸。在一些实施例中，该药物制剂包含40％-60％(w/w)的环状多核糖核苷酸和1％-10％(w/w)、10％-20％(w/w)、20％-30％(w/w)、30％-40％(w/w)、40％-50％(w/w)、50％-60％(w/w)的线性多核糖核苷酸。在一些实施例中，该药物制剂包含60％-80％(w/w)的环状多核糖核苷酸和1％-10％(w/w)、10％-20％(w/w)、20％-30％(w/w)、30％-40％(w/w)的线性多核糖核苷酸。26.在另一方面，本披露提供了一种环状多核糖核苷酸的药物制剂，其中该环状多核糖核苷酸包含编码多肽免疫原的序列，并且其中该药物制剂包含不超过该药物制剂中总核糖核苷酸分子的75％(w/w)、60％(w/w)、50％(w/w)、40％(w/w)、30％(w/w)、20％(w/w)、15％(w/w)、10％(w/w)、5％(w/w)或1％(w/w)的线性多核糖核苷酸分子。在一些实施例中，该药物制剂包含不超过该药物制剂中总核糖核苷酸分子的20％(w/w)、15％(w/w)、10％(w/w)、5％(w/w)、1％(w/w)或0.5％(w/w)的线性多核糖核苷酸分子。27.在一些实施例中，该制剂包括不超过该药物制剂中总核糖核苷酸分子的15％(w/w)(例如，15％(w/w)、10％(w/w)、9％(w/w)、8％(w/w)、7％(w/w)、6％(w/w)、5％(w/w)、4％(w/w)、3％(w/w)、2％(w/w)、1％(w/w)和0.5％(w/w))的带切口的多核糖核苷酸分子。在一些实施例中，该制剂包括不超过该药物制剂中总核糖核苷酸分子的8％(w/w)、7％(w/w)、6％(w/w)、5％(w/w)、4％(w/w)、3％(w/w)、2％(w/w)、1％(w/w)或0.5％(w/w)的带切口的多核糖核苷酸分子。28.在另一方面，本披露提供了一种环状多核糖核苷酸的药物制剂，其中该环状多核糖核苷酸包含编码多肽免疫原的序列，并且其中该药物制剂包含不超过该药物制剂中总核糖核苷酸分子的15％(w/w)(例如，15％(w/w)、10％(w/w)、9％(w/w)、8％(w/w)、7％(w/w)、6％(w/w)、5％(w/w)、4％(w/w)、3％(w/w)、2％(w/w)、1％(w/w)和0.5％(w/w))的带切口的多核糖核苷酸分子。在一些实施例中，该制剂包括不超过该药物制剂中总核糖核苷酸分子的8％(w/w)、7％(w/w)、6％(w/w)、5％(w/w)、4％(w/w)、3％(w/w)、2％(w/w)、1％(w/w)或0.5％(w/w)的带切口的多核糖核苷酸分子。29.在本文所述的药物制剂中的一种的一些实施例中，如通过鲎变形细胞裂解物测试所测量，该药物制剂包含少于10eu/kg(例如，9eu/kg、8eu/kg、7eu/kg、6eu/kg、5eu/kg、4eu/kg、3eu/kg、2eu/kg和1eu/kg)内毒素或缺少内毒素。在一些实施例中，该药物制剂在灭菌之前包含少于100cfu/100ml或少于10cfu/100ml的生物负荷。在一些实施例中，该药物制剂是无菌药物制剂，例如在无菌条件下所测试支持少于100个活微生物的生长。在一些实施例中，该药物制剂符合usp《71》的标准。在一些实施例中，该药物制剂符合usp《85》的标准。在一些实施例中，该药物制剂是最终成品药的中间体药物制剂。30.在一些实施例中，该药物制剂是用于施用至受试者的最终成品药。在一些实施例中，该药物制剂包含浓度为至少0.1ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、500μg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、100mg/ml、200mg/ml或500mg/ml的环状多核糖核苷酸分子。在一些实施例中，该药物制剂包含不超过1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、1000μg/ml、5000μg/ml、10,000μg/ml、或100,000μg/ml的脱氧核糖核苷酸分子。在一些实施例中，该药物制剂包含少于0.1ng、1ng、5ng、10ng、15ng、20ng、25ng、30ng、35ng、40ng、50ng、60ng、70ng、80ng、90ng、100ng、200ng、300ng、400ng、或500ng蛋白质污染物/毫克(mg)环状多核糖核苷酸分子的蛋白质污染物(例如酶)。在一些实施例中，该药物制剂包含如通过分光光度计测量的约1.6至2.3(例如，1.7、1.8、1.9、2.0、2.1和2.2)的a260/a280吸光度比。31.在一些实施例中，该药物制剂基本上不含选自以下项的工艺相关杂质：细胞蛋白质、细胞脱氧核糖核酸、酶、试剂组分、凝胶组分、或色谱材料。在一些实施例中，该药物制剂在纯化之后与纯化之前相比具有降低水平的免疫或炎性反应的一种或多种标记物。在一些实施例中，该环状多核糖核苷酸是本文所述的环状多核糖核苷酸。32.在一些实施例中，该环状多核糖核苷酸根据包括以下步骤的方法产生：提供多个线性多核糖核苷酸分子；使这些线性多核糖核苷酸分子环化以提供环状多核糖核苷酸分子的制剂；并且处理该制剂以从该制剂中去除线性多核糖核苷酸分子。在一些实施例中，该方法进一步包括评价该制剂中在该处理步骤之后剩余的线性多核糖核苷酸分子的量。在一些实施例中，该方法进一步包括进一步处理该制剂，其中进一步处理包括：处理该制剂以从该制剂中去除带切口的多核糖核苷酸分子；和/或处理该制剂以从该制剂中去除脱氧核糖核苷酸分子；和/或处理该制剂以从该制剂中去除蛋白质污染物；和/或处理该制剂以从该制剂中去除内毒素。33.在另一方面，本披露提供了一种药物组合物，该药物组合物包含本文所述的环状多核糖核苷酸、组合物或药物制剂中的任一种以及药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，药物组合物包含本文所述的环状多核糖核苷酸、组合物或药物制剂中的任一种和鱼精蛋白(protamine)或鱼精蛋白盐(例如，硫酸鱼精蛋白)。在一些实施例中，该药物组合物进一步包含佐剂。在一些实施例中，该佐剂是无机佐剂、小分子佐剂和水包油乳剂、脂质或聚合物、肽或肽聚糖、碳水化合物或多糖、皂苷、基于rna的佐剂、基于dna的佐剂、病毒颗粒、细菌佐剂、杂交分子、真菌或卵母细胞微生物相关分子模式(mamp)、无机纳米颗粒或多组分佐剂。在一些实施例中，该佐剂是无机佐剂。在一些实施例中，该无机佐剂是铝盐或钙盐。在一些实施例中，该佐剂是小分子。在一些实施例中，该小分子是咪喹莫特(imiquimod)、瑞喹莫德(resiquimod)或嘎德莫特(gardiquimod)。在一些实施例中，该佐剂是水包油乳剂。在一些实施例中，该水包油乳剂是角鲨烯、mf59、as03、montanide配制品(任选montanideisa51或montanideisa720)或不完全弗氏佐剂(一种水包油乳剂)。在一些实施例中，该佐剂是脂质或聚合物。在一些实施例中，该脂质或聚合物是聚合物纳米颗粒，任选地plga、plg、pla、pga或phb；脂质体，任选地病毒体或caf01；脂质纳米颗粒或其组分；脂多糖(lps)，任选地单磷酰基脂质a(mpla)或吡喃葡糖苷脂质a(gla)；脂肽，任选地pam2(pam2csk4)或pam3(pam3csk4)；或糖脂，任选地海藻糖二霉菌酸酯。在一些实施例中，该佐剂是肽或肽聚糖。在一些实施例中，该肽或肽聚糖对应于合成或纯化的革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌的全部或一部分，任选地n-乙酰-胞壁酰-l-丙氨酰-d-异谷氨酰胺(mdp)、鞭毛蛋白融合蛋白、甘露糖结合凝集素(mbl)、细胞因子或趋化因子。在一些实施例中，该佐剂是碳水化合物或多糖。在一些实施例中，该碳水化合物或多糖是右旋糖酐(微生物支多糖)、硫酸右旋糖酐、香菇多糖、酵母聚糖、β-葡聚糖、deltin、甘露聚糖或几丁质。在一些实施例中，该佐剂是皂苷。在一些实施例中，该皂苷是附接至一条或多条糖侧链的糖苷或多环苷元，任选地是iscoms、iscoms基质或qs-21。在一些实施例中，该佐剂是基于rna的佐剂。在一些实施例中，基于rna的佐剂是聚ic、聚ic:lc、发夹rna(任选地具有含5'ppp的序列)、病毒序列、含聚u的序列、dsrna、天然或合成的免疫刺激rna序列、核酸类似物，任选地环状gmp-amp或环状二核苷酸(诸如环状二gmp)，或免疫刺激性碱基类似物，任选地c8取代或n7,c8二取代的鸟嘌呤核糖核苷酸。在一些实施例中，该佐剂是基于dna的佐剂。在一些实施例中，基于dna的佐剂是cpg、dsdna或天然或合成的免疫刺激dna序列。在一些实施例中，该佐剂是病毒颗粒。在一些实施例中，病毒颗粒是病毒体，任选地是磷脂细胞膜双层。在一些实施例中，该佐剂是细菌佐剂。在一些实施例中，细菌佐剂是鞭毛蛋白、lps或细菌毒素，任选地肠毒素、热不稳定性毒素或霍乱毒素。在一些实施例中，该佐剂是杂交分子。在一些实施例中，该佐剂是与咪喹莫特缀合的cpg。在一些实施例中，该佐剂是真菌或卵母细胞微生物相关分子模式(mamp)。在一些实施例中，真菌或卵母细胞mamp是几丁质或β-葡聚糖。在一些实施例中，该佐剂是无机纳米颗粒。在一些实施例中，无机纳米颗粒是金纳米棒、基于二氧化硅的纳米颗粒，任选地是介孔二氧化硅纳米颗粒(msn)。在一些实施例中，该佐剂是多组分佐剂。在一些实施例中，多组分佐剂是as01、as03、as04、完全弗氏佐剂或caf01。34.在另一方面，本披露提供了一种包括混合物的药物组合物，该混合物包含本文所述的环状多核糖核苷酸、组合物或药物制剂中的任一种以及醇，其中醇占混合物的约0.3％v/v至约75％v/v(例如，0.5％v/v、1％v/v、5％v/v、10％v/v、15％v/v、20％v/v、25％v/v、30％v/v、35％v/v、40％v/v、45％v/v、50％v/v、55％v/v、60％v/v、65％v/v和70％v/v)。35.在另一方面，本披露提供了一种包括混合物的药物组合物，该混合物包含含有至少一个编码多肽免疫原的序列的线性多核糖核苷酸和醇，其中醇占混合物的约0.3％v/v至约75％v/v(例如，0.5％v/v、1％v/v、5％v/v、10％v/v、15％v/v、20％v/v、25％v/v、30％v/v、35％v/v、40％v/v、45％v/v、50％v/v、55％v/v、60％v/v、65％v/v和70％v/v)。36.在一些实施例中，线性多核糖核苷酸包含多个序列，每个序列编码多肽免疫原，其中这些多肽免疫原中的至少两种(例如，至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种和至少九种)具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％)的氨基酸序列同一性。在一些实施例中，该至少两种多肽免疫原具有至少95％(例如，96％、至少97％、至少98％和至少99％)的氨基酸序列同一性。在一些实施例中，该至少两种多肽免疫原具有小于100％的氨基酸序列同一性。在一些实施例中，这些多肽免疫原中的每一种包括一个或多个鉴别靶标的表位。在一些实施例中，该靶标是病原体。在一些实施例中，该病原体是病毒、细菌、真菌或寄生虫。在一些实施例中，病原体是病毒并且每种多肽免疫原包括对应于病毒免疫原的一个或多个表位(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)。在一些实施例中，病原体是细菌并且每种多肽免疫原包括对应于细菌免疫原的一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)表位。在一些实施例中，该靶标是癌细胞。在一些实施例中，多肽免疫原包括对应于肿瘤抗原的一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)表位。在一些实施例中，该靶标是毒素或过敏原。在一些实施例中，该靶标与疾病、病症或病状相关。在一些实施例中，该疾病、病症或病状是病毒感染。在一些实施例中，该疾病、病症或病状是细菌感染。在一些实施例中，该疾病、病症或病状是癌症。37.在一些实施例中，线性多核糖核苷酸包含多个序列，每个序列编码多肽免疫原，其中这些多肽免疫原中的至少两种(例如，至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种和至少九种)鉴别不同的蛋白质，其中这些不同的蛋白质中的每一种鉴别相同的靶标。在一些实施例中，这些多肽免疫原中的每一种鉴别不同的蛋白质。在一些实施例中，该靶标是病原体。在一些实施例中，该病原体是病毒、细菌、真菌或寄生虫。在一些实施例中，该病原体是病毒并且这些不同的蛋白质中的每一种是与该病毒相关的病毒蛋白质。在一些实施例中，该病原体是细菌并且这些不同的蛋白质中的每一种是与该细菌相关的细菌蛋白质。在一些实施例中，该靶标是癌细胞。在一些实施例中，这些不同的蛋白质中的每一种是与该癌细胞相关的不同肿瘤抗原。在一些实施例中，该靶标是过敏原或毒素。38.在一些实施例中，线性多核糖核苷酸包含多个序列，每个序列编码多肽免疫原，其中这些多肽免疫原中的至少两种(例如，至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种和至少九种)鉴别不同的靶标。在一些实施例中，这些多肽免疫原中的每一种鉴别不同的靶标。在一些实施例中，每个靶标是不同的病原体。在一些实施例中，每个靶标独立地是癌细胞、病毒、细菌、真菌或寄生虫。在一些实施例中，每个靶标是不同的病毒。在一些实施例中，每个靶标是不同的细菌。在一些实施例中，这些靶标包括病毒和细菌。39.在一些实施例中，线性多核糖核苷酸包含至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个或至少九个序列，每个序列编码多肽免疫原。在一些实施例中，线性多核糖核苷酸包含两个至三个、两个至五个(例如三个至四个)或五个至十个序列(例如，六个、七个、八个和九个序列)，每个序列编码多肽免疫原。40.在一些实施例中，线性多核糖核苷酸进一步包含编码佐剂的至少一个序列(例如，至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个序列)。在一些实施例中，编码该佐剂的该至少一个序列(例如，至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个序列)与ires可操作地连接。41.在一些实施例中，线性多核糖核苷酸包含编码多肽免疫原的序列和编码佐剂的序列或作为先天性免疫系统刺激剂的序列。在一些实施例中，编码该多肽免疫原的该序列与ires可操作地连接。在一些实施例中，编码该佐剂的该序列与ires可操作地连接。在一些实施例中，该佐剂是多肽。在一些实施例中，佐剂是细胞因子、趋化因子、共刺激分子、先天性免疫刺激剂、信号传导分子、转录激活因子、细胞因子受体、细菌组分或先天性免疫系统的组分。在一些实施例中，该细胞因子是促炎性细胞因子。在一些实施例中，该促炎性细胞因子选自gm-csf、il-1α、il-1β、tgf-β、tnf-α和tnf-β。在一些实施例中，该细胞因子是th-1诱导性细胞因子。在一些实施例中，该th-1诱导性细胞因子选自ifn-γ、il-2、il-12、il-15和il-18。在一些实施例中，该细胞因子是th-2诱导性细胞因子。在一些实施例中，该th-2诱导性细胞因子选自ifn-γ、il-4、il-5、il-6、il-10和il-13。在一些实施例中，该趋化因子选自mcp-1、mip-1α、mip-1β、rantes和tca-3。在一些实施例中，该共刺激分子选自cd80、cd86、cd40-l、cd70和cd27。在一些实施例中，先天性免疫刺激剂选自sting(例如，组成型活性sting(casting)，诸如stingv155m、stingr284m、stingr284m/v147l/n154s/v155m或stingv147l/n154s/v155m)、tlr3、tlr4、tlr9、tlr7、tlr8、tlr7、rig-i/ddx58和mda-5/ifih1。在一些实施例中，该先天性免疫刺激剂是组成型活性突变体。在一些实施例中，该信号传导分子选自sting(例如，casting，诸如stingv155m、stingr284m、stingr284m/v147l/n154s/v155m或stingv147l/n154s/v155m)、trif、tram、myd88、ips1、asc、mavs、mapk、ikk-α、ikk复合物、tbk1、b-连环蛋白和半胱天冬酶1。在一些实施例中，该转录激活因子选自ap1、nf-κb、irf3、irf7、irf1和irf5。在一些实施例中，该细胞因子受体选自il-2βr、ifn-γr和il-6r。在一些实施例中，该细菌组分选自鞭毛蛋白和mbl。42.在一些实施例中，线性多核糖核苷酸包含作为先天性免疫系统刺激剂的序列。在一些实施例中，作为先天性免疫系统刺激剂的该序列是富含gu的基序、富含au的基序、包含dsrna的结构化区域、或适体。43.在一些实施例中，醇占混合物的约0.3％v/v至约60％v/v(例如，0.5％v/v、1％v/v、5％v/v、10％v/v、15％v/v、20％v/v、25％v/v、30％v/v、35％v/v、40％v/v、45％v/v、50％v/v和55％v/v)、约0.3％v/v至约50％v/v(例如，0.5％v/v、1％v/v、5％v/v、10％v/v、15％v/v、20％v/v、25％v/v、30％v/v、35％v/v、40％v/v和45％v/v)、约0.3％v/v至约40％v/v(例如，0.5％v/v、1％v/v、5％v/v、10％v/v、15％v/v、20％v/v、25％v/v、30％v/v和35％v/v)、约0.3％v/v至约20％v/v、约0.3％v/v至约15％v/v(例如，0.5％v/v、1％v/v、5％v/v、10％v/v和15％v/v)、约0.3％v/v至约10％v/v(例如，0.5％v/v、1％v/v、5％v/v和10％v/v)、约0.3％v/v至约5％v/v(例如，0.5％v/v、1％v/v、2％v/v、3％v/v和4％v/v)、约0.3％v/v至约1％v/v(例如，0.4％v/v、0.5％v/v、0.6％v/v、0.7％v/v、0.8％v/v和0.9％v/v)或约0.3％v/v至约0.5％v/v。在一些实施例中，醇占混合物的约0.5％v/v至约75％v/v、约1％v/v至约75％v/v、约5％v/v至约75％v/v、约10％v/v至约75％v/v、约15％v/v至约75％v/v、约20％v/v至约75％v/v、约30％v/v至约75％v/v、约40％v/v至约75％v/v、约50％v/v至约75％v/v、约60％v/v至约75％v/v、或约70％v/v至约75％v/v。44.在一些实施例中，醇选自甲醇、乙醇、异丙醇、苯氧乙醇、三乙醇胺、苯乙醇、丁醇、戊醇、鲸蜡醇、乙二醇、丙二醇、变性醇、苯甲醇(特别是变性醇)、二醇、硬脂醇、鲸蜡硬脂醇、薄荷醇、聚乙二醇(peg)-400、乙氧基化脂肪酸和羟乙基纤维素。在一些实施例中，醇是乙醇。45.在一些实施例中，药物组合物被配制用于局部施用。在一些实施例中，药物组合物是液体、凝胶、润肤露、糊剂、乳膏、泡沫或棒。在一些实施例中，药物组合物的ph为约6-8(例如，约6.5-7.5，或约7)。在一些实施例中，药物组合物具有与水大致相同的粘度。46.在一些实施例中，药物组合物基本上不含疏水性或亲脂性基团。在一些实施例中，药物组合物基本上不含烃。在一些实施例中，药物组合物基本上不含阳离子脂质体。在一些实施例中，药物组合物基本上不含脂肪酸、脂质、脂质体、胆固醇或其任何组合。在一些实施例中，该组合物进一步包含佐剂。在一些实施例中，该佐剂是无机佐剂、小分子佐剂和水包油乳剂、脂质或聚合物、肽或肽聚糖、碳水化合物或多糖、皂苷、基于rna的佐剂、基于dna的佐剂、病毒颗粒、细菌佐剂、杂交分子、真菌或卵母细胞微生物相关分子模式(mamp)、无机纳米颗粒或多组分佐剂。在一些实施例中，该组合物进一步包含细胞穿透剂。47.在另一方面，本披露提供了一种向受试者递送多核糖核苷酸的方法，该方法包括向受试者的表面区域局部施加本文所述的环状多核糖核苷酸、本文所述的免疫原性组合物、本文所述的药物制剂。48.在另一方面，本披露提供了一种向受试者递送多核糖核苷酸的方法，该方法包括：(a)将灭菌剂施加至该受试者的表面区域；以及(b)将包括本文所述的环状多核糖核苷酸、本文所述的免疫原性组合物、本文所述的药物制剂或本文所述的药物组合物和稀释剂的组合物施加至受试者的表面区域。在一些实施例中，(b)的组合物不包含载剂。在一些实施例中，灭菌剂是醇、紫外光、激光或热。49.在另一方面，本披露提供了一种向受试者递送多核糖核苷酸的方法，该方法包括：(a)将醇施加至该受试者的表面区域；以及(b)将包括本文所述的环状多核糖核苷酸、本文所述的免疫原性组合物、本文所述的药物制剂或本文所述的药物组合物和稀释剂的组合物施加至受试者的表面区域。在一些实施例中，醇选自由以下组成的组：甲醇、乙醇、异丙醇、苯氧乙醇、三乙醇胺、苯乙醇、丁醇、戊醇、鲸蜡醇、乙二醇、丙二醇、变性醇、苯甲醇(特别是变性醇)、二醇、硬脂醇、鲸蜡硬脂醇、薄荷醇、聚乙二醇(peg)-400、乙氧基化脂肪酸和羟乙基纤维素。在一些实施例中，醇是乙醇。50.在一些实施例中(例如，在本文所述的局部递送的一些实施例中)，受试者的表面区域选自皮肤、口腔、鼻腔、胃肠道、呼吸道或其任何组合的表面区域。51.在另一方面，本披露提供了一种治疗或预防受试者的疾病、病症或病状的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的环状多核糖核苷酸、组合物、药物制剂或药物组合物中的任一种。在一些实施例中，该疾病、病症或病状是病毒感染、细菌感染、真菌感染。在一些实施例中，该疾病、病症或病状是癌症。在一些实施例中，该疾病、病症或病状与暴露于过敏原相关。在一些实施例中，该疾病、病症或病状与暴露于毒素相关。52.在另一方面，本披露提供了一种在受试者中诱导免疫反应的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的环状多核糖核苷酸、组合物、药物制剂或药物组合物中的任一种。在一些实施例中，受试者是哺乳动物。在一些实施例中，受试者是人。在一些实施例中，该方法是非人哺乳动物。在一些实施例中，非人哺乳动物是牛、绵羊、山羊、猪、狗、马或猫。在一些实施例中，受试者是鸟。在一些实施例中，鸟是母鸡、公鸡、火鸡或鹦鹉。在一些实施例中，该方法进一步包括向该受试者施用佐剂。在一些实施例中，该佐剂是与环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸或其制剂或组合物分开的分子实体。在一些实施例中，该佐剂是无机佐剂、小分子佐剂和水包油乳剂、脂质或聚合物、肽或肽聚糖、碳水化合物或多糖、皂苷、基于rna的佐剂、基于dna的佐剂、病毒颗粒、细菌佐剂、杂交分子、真菌或卵母细胞微生物相关分子模式(mamp)、无机纳米颗粒或多组分佐剂。在一些实施例中，该佐剂是多肽佐剂。在一些实施例中，多肽佐剂是细胞因子、趋化因子、共刺激分子、先天性免疫刺激剂、信号传导分子、转录激活因子、细胞因子受体、细菌组分或先天性免疫系统的组分。在一些实施例中，该佐剂是先天性免疫系统刺激剂。在一些实施例中，先天性免疫系统刺激剂选自包括富含gu的基序、富含au的基序、包含dsrna的结构化区域、或适体的rna。53.在一些实施例中，将本文所述的环状多核糖核苷酸、组合物、药物制剂或药物组合物中的任一种作为单剂量施用给受试者。在一些实施例中，将本文所述的环状多核糖核苷酸、组合物、药物制剂或药物组合物中的任一种向受试者施用两次或更多次、三次或更多次、四次或更多次、或五次或更多次。在一些实施例中，本文所述的环状多核糖核苷酸、组合物、药物制剂或药物组合物中的任一种的施用约每周一次，约每两周一次，约每三周一次，约每个月一次，约每两个月一次，约每三个月一次，约每四个月一次，约每五个月一次，约每六个月一次，约每年一次，约每两年一次，约每三年一次，约每四年一次，约每五年一次，或约每十年一次。54.在一些实施例中，该方法进一步包括向受试者施用多肽免疫原(例如，包含多肽免疫原的蛋白质亚基)。在一些实施例中，多肽免疫原对应于由环状多核糖核苷酸序列编码的多肽免疫原(例如，与之具有90％、95％、96％、97％、98％或100％的氨基酸序列同一性)。在一些实施例中，在施用本文所述的环状多核糖核苷酸、免疫原性组合物、药物制剂或药物组合物中的任一种之后，向受试者施用多肽免疫原。在一些实施例中，该多肽免疫原维持或增强该受试者针对该多肽免疫原的免疫反应。55.在另一方面，本披露提供了一种维持或增强受试者的免疫反应的方法，该方法包括(i)向该受试者施用编码多肽免疫原的环状多核糖核苷酸并且(ii)向该受试者施用该多肽免疫原，其中步骤(ii)发生在步骤(i)之后的1周至6个月之间(例如1个月至5个月之间，2个月至3个月之间，2周至3个月之间，或3个月至6个月之间)，并且其中步骤(ii)的该多肽免疫原的施用维持或增强该受试者针对该多肽免疫原的免疫反应。在一些实施例中，多肽免疫原包含一个或多个鉴别靶标的表位。在一些实施例中，该靶标是病原体。在一些实施例中，该靶标是癌细胞、过敏原或毒素。56.编号的实施例：57.[1]一种环状多核糖核苷酸，该环状多核糖核苷酸包含多个序列，每个序列编码多肽免疫原，其中这些多肽免疫原中的至少两种具有至少90％的氨基酸序列同一性。[0058][2]如段落[1]所述的环状多核糖核苷酸，其中该至少两种多肽免疫原具有至少95％的氨基酸序列同一性。[0059][3]如段落[1]或[2]所述的环状多核糖核苷酸，其中该至少两种多肽免疫原具有小于100％的氨基酸序列同一性。[0060][4]如段落[1]所述的环状多核糖核苷酸，其中这些多肽免疫原中的每一种具有至少90％的氨基酸序列同一性。[0061][5]如段落[4]所述的环状多核糖核苷酸，其中这些多肽免疫原中的每一种具有至少95％的氨基酸序列同一性。[0062][6]如段落[4]或[5]所述的环状多核糖核苷酸，其中这些多肽免疫原中的每一种具有小于100％的氨基酸序列同一性。[0063][7]如段落[1]至[6]中任一项所述的环状多核糖核苷酸，其中这些多肽免疫原中的每一种包含一个或多个鉴别靶标的表位。[0064][8]如段落[7]所述的环状多核糖核苷酸，其中该靶标是病原体。[0065][9]如段落[8]所述的环状多核糖核苷酸，其中该病原体是病毒、细菌、真菌或寄生虫。[0066][10]如段落[9]所述的环状多核糖核苷酸，其中该病原体是病毒，并且每种多肽免疫原包含对应于病毒免疫原的一个或多个表位。[0067][11]如段落[9]所述的环状多核糖核苷酸，其中该病原体是细菌，并且每种多肽免疫原包含对应于细菌免疫原的一个或多个表位。[0068][12]如段落[7]所述的环状多核糖核苷酸，其中该靶标是癌细胞。[0069][13]如段落[12]所述的环状多核糖核苷酸，其中每种多肽免疫原包含对应于肿瘤抗原的一个或多个表位。[0070][14]如段落[7]所述的环状多核糖核苷酸，其中该靶标是毒素或过敏原。[0071][15]如段落[7]至[14]中任一项所述的环状多核糖核苷酸，其中该靶标与疾病、病症或病状相关。[0072][16]如段落[15]所述的环状多核糖核苷酸，其中该疾病、病症或病状是病毒感染。[0073][17]如段落[15]所述的环状多核糖核苷酸，其中该疾病、病症或病状是细菌感染。[0074][18]如段落[15]所述的环状多核糖核苷酸，其中该疾病、病症或病状是癌症。[0075][19]一种环状多核糖核苷酸，该环状多核糖核苷酸包含多个序列，每个序列编码多肽免疫原，其中这些多肽免疫原中的至少两种鉴别不同的蛋白质，其中这些不同的蛋白质中的每一种鉴别相同的靶标。[0076][20]如段落[19]所述的环状多核糖核苷酸，其中这些多肽免疫原中的每一种鉴别不同的蛋白质。[0077][21]如段落[19]或[20]所述的环状多核糖核苷酸，其中该靶标是病原体。[0078][22]如段落[21]所述的环状多核糖核苷酸，其中该病原体是病毒、细菌、真菌或寄生虫。[0079][23]如段落[22]所述的环状多核糖核苷酸，其中该病原体是病毒并且这些不同的蛋白质中的每一种是与该病毒相关的病毒蛋白质。[0080][24]如段落[22]所述的环状多核糖核苷酸，其中该病原体是细菌并且这些不同的蛋白质中的每一种是与该细菌相关的细菌蛋白质。[0081][25]如段落[19]或[20]所述的环状多核糖核苷酸，其中该靶标是癌细胞[0082][26]如段落[25]所述的环状多核糖核苷酸，其中这些不同的蛋白质中的每一种是与该癌细胞相关的不同肿瘤抗原。[0083][27]如段落[19]或[20]所述的环状多核糖核苷酸，其中该靶标是过敏原或毒素。[0084][28]一种环状多核糖核苷酸，该环状多核糖核苷酸包含多个序列，每个序列编码多肽免疫原，其中这些多肽免疫原中的至少两种鉴别不同的靶标。[0085][29]如段落[28]所述的环状多核糖核苷酸，其中这些多肽免疫原中的每一种鉴别不同的靶标。[0086][30]如段落[28]或[29]所述的环状多核糖核苷酸，其中每个靶标是不同的病原体。[0087][31]如段落[30]所述的环状多核糖核苷酸，其中每个靶标独立地是癌细胞、病毒、细菌、真菌或寄生虫。[0088][32]如段落[31]所述的环状多核糖核苷酸，其中每个靶标是不同的病毒。[0089][33]如段落[31]所述的环状多核糖核苷酸，其中每个靶标是不同的细菌。[0090][34]如段落[31]所述的环状多核糖核苷酸，其中这些靶标包括病毒和细菌。[0091][35]如段落[1]至[34]中任一项所述的环状多核糖核苷酸，其中该环状多核糖核苷酸包含500至20,000个核糖核苷酸。[0092][36]如段落[35]所述的环状多核糖核苷酸，其中该环状多核糖核苷酸包含500至10,000个核糖核苷酸。[0093][37]如段落[36]所述的环状多核糖核苷酸，其中该环状多核糖核苷酸包含500至5,000个核糖核苷酸。[0094][38]如段落[1]至[34]中任一项所述的环状多核糖核苷酸，其中该环状多核糖核苷酸包含至少500个核糖核苷酸。[0095][39]如段落[38]所述的环状多核糖核苷酸，其中该环状多核糖核苷酸包含至少1,000个核糖核苷酸。[0096][40]如段落[39]所述的环状多核糖核苷酸，其中该环状多核糖核苷酸包含至少5,000个核糖核苷酸。[0097][41]如段落[1]至[40]中任一项所述的环状多核糖核苷酸，其中该环状多核糖核苷酸包含至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个或至少九个序列，每个序列编码多肽免疫原。[0098][42]如段落[1]至[40]中任一项所述的环状多核糖核苷酸，其中该环状多核糖核苷酸包含两个至三个、两个至五个或五个至十个序列，每个序列编码多肽免疫原。[0099][43]如段落[1]至[40]中任一项所述的环状多核糖核苷酸，其中至少一个编码多肽免疫原的序列进一步编码信号序列。[0100][44]如段落[1]至[40]中任一项所述的环状多核糖核苷酸，其中每个编码多肽免疫原的序列进一步编码信号序列。[0101][45]如段落[1]至[44]中任一项所述的环状多核糖核苷酸，其中编码这些多肽免疫原中的每一种的每一个序列与内部核糖体进入位点(ires)可操作地连接。[0102][46]如段落[45]所述的环状多核糖核苷酸，其中该环状多核糖核苷酸包含单个ires。[0103][47]如段落[46]所述的环状多核糖核苷酸，其中这些多肽免疫原中的每一种由与该单个ires可操作地连接的单个开放阅读框编码，其中该开放阅读框的表达产生包含这些多肽免疫原中的每一种的氨基酸序列的多肽。[0104][48]如段落[47]所述的环状多核糖核苷酸，其中这些多肽免疫原各自被多肽接头隔开。[0105][49]如段落[47]所述的环状多核糖核苷酸，其中这些多肽免疫原各自被裂解结构域隔开。[0106][50]如段落[49]所述的环状多核糖核苷酸，其中每个交错元件是2a自裂解肽。[0107][51]如段落[45]所述的环状多核糖核苷酸，其中该环状多核糖核苷酸包含多个ires。[0108][52]如段落[51]所述的环状多核糖核苷酸，其中每个ires与包含编码多肽免疫原的序列的开放阅读框可操作地连接。[0109][53]如段落[1]至[52]中任一项所述的环状多核糖核苷酸，其中该环状多核糖核苷酸进一步包含至少一个编码佐剂的序列。[0110][54]如段落[53]所述的环状多核糖核苷酸，其中该至少一个编码该佐剂的序列与ires可操作地连接。[0111][55]如段落[53]或[54]所述的环状多核糖核苷酸，其中该佐剂是多肽。[0112][56]如段落[55]所述的环状多核糖核苷酸，其中该佐剂是细胞因子、趋化因子、共刺激分子、先天性免疫刺激剂、信号传导分子、转录激活因子、细胞因子受体、细菌组分或先天性免疫系统的组分。[0113][57]如段落[56]所述的环状多核糖核苷酸，其中该细胞因子是促炎性细胞因子。[0114][58]如段落[57]所述的环状多核糖核苷酸，其中该促炎性细胞因子选自gm-csf、il-1α、il-1β、tgf-β、tnf-α和tnf-β。[0115][59]如段落[57]所述的环状多核糖核苷酸，其中该细胞因子是th-1诱导性细胞因子。[0116][60]如段落[59]所述的环状多核糖核苷酸，其中该th-1诱导性细胞因子选自ifn-γ、il-2、il-12、il-15和il-18。[0117][61]如段落[56]所述的环状多核糖核苷酸，其中该细胞因子是th-2诱导性细胞因子。[0118][62]如段落[61]所述的环状多核糖核苷酸，其中该th-2诱导性细胞因子选自ifn-γ、il-4、il-5、il-6、il-10和il-13。[0119][63]如段落[56]所述的环状多核糖核苷酸，其中该趋化因子选自mcp-1、mip-1α、mip-1β、rantes和tca-3。[0120][64]如段落[56]所述的环状多核糖核苷酸，其中该共刺激分子选自cd80、cd86、cd40-l、cd70和cd27。[0121][65]如段落[56]所述的环状多核糖核苷酸，其中该先天性免疫刺激剂选自sting(例如，casting)、tlr3、tlr4、tlr9、tlr7、tlr8、tlr7、rig-i/ddx58和mda-5/ifih1。[0122][66]如段落[65]所述的环状多核糖核苷酸，其中该先天性免疫刺激剂是组成型活性突变体。[0123][67]如段落[567]所述的环状多核糖核苷酸，其中该信号传导分子选自sting(例如，casting)、trif、tram、myd88、ips1、asc、mavs、mapk、ikk-α、ikk复合物、tbk1、b-连环蛋白和半胱天冬酶1。[0124][68]如段落[56]所述的环状多核糖核苷酸，其中该转录激活因子选自ap1、nf-κb、irf3、irf7、irf1和irf5。[0125][69]如段落[56]所述的环状多核糖核苷酸，其中该细胞因子受体选自il-2βr、ifn-γr和il-6r。[0126][70]如段落[56]所述的环状多核糖核苷酸，其中该细菌组分选自鞭毛蛋白和mbl。[0127][71]如段落[53]至[70]中任一项所述的环状多核糖核苷酸，其中至少一个编码佐剂的序列进一步编码信号序列。[0128][72]如段落[1]至[70]中任一项所述的环状多核糖核苷酸，其中该环状多核糖核苷酸进一步包含作为先天性免疫系统刺激剂的序列。[0129][73]如段落[72]所述的环状多核糖核苷酸，其中作为先天性免疫系统刺激剂的该序列是富含gu的基序、富含au的基序、包含dsrna的结构化区域、或适体。[0130][74]一种环状多核糖核苷酸，该环状多核糖核苷酸包含(a)编码多肽免疫原的序列和(b)编码佐剂的序列或作为先天性免疫系统刺激剂的序列。[0131][75]如段落[74]所述的环状多核糖核苷酸，其中编码该多肽免疫原的该序列与ires可操作地连接。[0132][76]如段落[74]或[75]所述的环状多核糖核苷酸，其中编码该佐剂的该序列与ires可操作地连接。[0133][77]如段落[74]至[76]中任一项所述的环状多核糖核苷酸，其中该佐剂是多肽。[0134][78]如段落[77]所述的环状多核糖核苷酸，其中该多肽免疫原和该佐剂多肽由与该单个ires可操作地连接的单个开放阅读框编码，其中该开放阅读框的表达产生包含该多肽免疫原和该佐剂多肽中的每一种的氨基酸序列的多肽。[0135][79]如段落[78]所述的环状多核糖核苷酸，其中该多肽免疫原和该佐剂多肽各自被多肽接头隔开。[0136][80]如段落[78]所述的环状多核糖核苷酸，其中该多肽免疫原和该佐剂多肽各自被裂解结构域隔开。[0137][81]如段落[80]所述的环状多核糖核苷酸，其中每个交错元件是2a自裂解肽。[0138][82]如段落[77]所述的环状多核糖核苷酸，其中该环状多核糖核苷酸包含多个ires。[0139][83]如段落[82]所述的环状多核糖核苷酸，其中第一ires与编码该多肽免疫原的该序列可操作地连接并且第二ires与编码该佐剂多肽的该序列可操作地连接。[0140][84]如段落[74]至[83]中任一项所述的环状多核糖核苷酸，其中编码该多肽免疫原的该序列的表达是编码该佐剂的该序列的表达的2倍。[0141][85]如段落[74]至[84]中任一项所述的环状多核糖核苷酸，其中编码该多肽免疫原的该序列的表达是编码该佐剂的该序列的表达的5倍、10倍或100倍。[0142][86]如段落[74]至[85]中任一项所述的环状多核糖核苷酸，其中该佐剂是细胞因子、趋化因子、共刺激分子、先天性免疫刺激剂、信号传导分子、转录激活因子、细胞因子受体、细菌组分或先天性免疫系统的组分。[0143][87]如段落[86]所述的环状多核糖核苷酸，其中该细胞因子是促炎性细胞因子。[0144][88]如段落[87]所述的环状多核糖核苷酸，其中该促炎性细胞因子选自gm-csf、il-1α、il-1β、tgf-β、tnf-α和tnf-β。[0145][89]如段落[86]所述的环状多核糖核苷酸，其中该细胞因子是th-1诱导性细胞因子。[0146][90]如段落[89]所述的环状多核糖核苷酸，其中该th-1诱导性细胞因子选自ifn-γ、il-2、il-12、il-15和il-18。[0147][91]如段落[86]所述的环状多核糖核苷酸，其中该细胞因子是th-2诱导性细胞因子。[0148][92]如段落[91]所述的环状多核糖核苷酸，其中该th-2诱导性细胞因子选自ifn-γ、il-4、il-5、il-6、il-10和il-13。[0149][93]如段落[86]所述的环状多核糖核苷酸，其中该趋化因子选自mcp-1、mip-1α、mip-1β、rantes和tca-3。[0150][94]如段落[93]所述的环状多核糖核苷酸，其中该共刺激分子选自cd80、cd86、cd40-l、cd70和cd27。[0151][95]如段落[86]所述的环状多核糖核苷酸，其中该先天性免疫刺激剂选自sting(例如，casting)、tlr3、tlr4、tlr9、tlr7、tlr8、tlr7、rig-i/ddx58和mda-5/ifih1。[0152][96]如段落[95]所述的环状多核糖核苷酸，其中该先天性免疫刺激剂是组成型活性突变体。[0153][97]如段落[86]所述的环状多核糖核苷酸，其中该信号传导分子选自sting(例如，casting)、trif、tram、myd88、ips1、asc、mavs、mapk、ikk-α、ikk复合物、tbk1、b-连环蛋白和半胱天冬酶1。[0154][98]如段落[86]所述的环状多核糖核苷酸，其中该转录激活因子选自ap1、nf-κb、irf3、irf7、irf1和irf5。[0155][99]如段落[86]所述的环状多核糖核苷酸，其中该细胞因子受体选自il-2βr、ifn-γr和il-6r。[0156][100]如段落[86]所述的环状多核糖核苷酸，其中该细菌组分选自鞭毛蛋白和mbl。[0157][101]如段落[74]至[100]中任一项所述的环状多核糖核苷酸，其中编码该佐剂的该序列进一步编码信号序列。[0158][102]如段落[74]至[101]中任一项所述的环状多核糖核苷酸，其中编码该多肽免疫原的该序列进一步编码信号序列。[0159][103]如段落[74]至[101]中任一项所述的环状多核糖核苷酸，其中编码该多肽免疫原的该序列不编码信号序列。[0160][104]如段落[74]或[75]所述的环状多核糖核苷酸，其中作为先天性免疫系统刺激剂的该序列选自富含gu的基序、富含au的基序、包含dsrna的结构化区域、或适体。[0161][105]如段落[1]至[104]中任一项所述的环状多核糖核苷酸其中该环状多核糖核苷酸包含具有5'末端和3'末端的第一多核糖核苷酸，其中5'末端和3'末端各自与第二多核苷酸杂交，由此连接第一多核糖核苷酸的5'末端和3'末端以形成环状多核糖核苷酸。[0162][106]如段落[105]所述的环状多核糖核苷酸，其中该环状多核糖核苷酸通过夹板连接产生。[0163][107]如段落[1]至[104]中任一项所述的环状多核糖核苷酸，其中通过提供具有3'末端和5'末端的线性多核糖核苷酸来产生该环状多核糖核苷酸，其中该3'末端和该5'末端各自包含内含子的一部分，并且其中该3'末端的内含子部分和该5'末端的内含子部分催化剪接反应，从而使该5'末端和该3'末端共价缀合以产生该环状多核糖核苷酸。[0164][108]如段落[107]所述的环状多核糖核苷酸，其中该内含子是i类自剪接内含子。[0165][109]一种包含多个环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物，每个环状多核糖核苷酸均包含编码多肽免疫原的序列。[0166][110]如段落[109]所述的免疫原性组合物，其中该多个环状多核糖核苷酸中的每一个均为段落中[1]至[108]中任一项所述的环状多核糖核苷酸。[0167][111]如段落[109]所述的免疫原性组合物，其中该组合物包含(a)包含编码第一多肽免疫原的序列的至少第一环状多核糖核苷酸和(b)包含编码第二多肽免疫原的序列的至少第二环状多核糖核苷酸，其中该第一多肽免疫原和第二多肽免疫原具有至少90％的氨基酸序列同一性。[0168][112]如段落[111]所述的免疫原性组合物，其中该第一多肽免疫原和第二多肽免疫原具有至少95％的氨基酸序列同一性。[0169][113]如段落[111]或[112]所述的免疫原性组合物，其中第一多肽免疫原和第二多肽免疫原具有小于100％的氨基酸序列同一性。[0170][114]如段落[111]至[113]中任一项所述的免疫原性组合物，其中这些多肽免疫原中的每一种包含一个或多个鉴别靶标的表位。[0171][115]如段落[114]所述的免疫原性组合物，其中该靶标是病原体。[0172][116]如段落[115]所述的免疫原性组合物，其中该靶标是癌细胞、过敏原或毒素。[0173][117]如段落[109]所述的免疫原性组合物，其中该组合物包含(a)包含编码第一多肽免疫原的序列的至少第一环状多核糖核苷酸和(b)包含编码第二多肽免疫原的序列的至少第二环状多核糖核苷酸，其中该第一多肽免疫原和第二多肽免疫原鉴别不同的蛋白质，其中每种不同的蛋白质鉴别相同的靶标。[0174][118]如段落[117]所述的免疫原性组合物，其中该靶标是病原体。[0175][119]如段落[118]所述的免疫原性组合物，其中该病原体是病毒、细菌、真菌或寄生虫。[0176][120]如段落[119]所述的免疫原性组合物，其中该病原体是癌细胞、过敏原或毒素。[0177][121]如段落[109]所述的免疫原性组合物，其中该组合物包含(a)包含编码第一多肽免疫原的序列的至少第一环状多核糖核苷酸和(b)包含编码第二多肽免疫原的序列的至少第二环状多核糖核苷酸，其中该第一多肽免疫原鉴别第一靶标而该第二多肽免疫原鉴别第二靶标。[0178][122]如段落[121]所述的免疫原性组合物，其中每个靶标是病原体。[0179][123]如段落[121]或[122]所述的免疫原性组合物，其中每个靶标独立地是癌细胞、病毒、细菌、真菌、寄生虫、毒素或过敏原。[0180][124]如段落[109]至[123]中任一项所述的免疫原性组合物，其中每种多肽免疫原均与ires可操作地连接。[0181][125]一种包含多种环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物，其中该组合物包含(a)包含编码多肽免疫原的序列的至少第一环状多核糖核苷酸，和(b)包含编码佐剂的序列或作为先天性免疫系统刺激剂的序列的至少第二环状多核糖核苷酸。[0182][126]如段落[125]所述的免疫原性组合物，其中该佐剂是多肽。[0183][127]如段落[126]所述的免疫原性组合物，其中该佐剂是细胞因子、趋化因子、共刺激分子、先天性免疫刺激剂、信号传导分子、转录激活因子、细胞因子受体、细菌组分或先天性免疫系统的组分。[0184][128]如段落[127]所述的免疫原性组合物，其中该细胞因子是促炎性细胞因子。[0185][129]如段落[128]所述的免疫原性组合物，其中该促炎性细胞因子选自gm-csf、il-1α、il-1β、tgf-β、tnf-α和tnf-β。[0186][130]如段落[127]所述的免疫原性组合物，其中该细胞因子是th-1诱导性细胞因子。[0187][131]如段落[130]所述的免疫原性组合物，其中该th-1诱导性细胞因子选自ifn-γ、il-2、il-12、il-15和il-18。[0188][132]如段落[127]所述的免疫原性组合物，其中该细胞因子是th-2诱导性细胞因子。[0189][133]如段落[132]所述的免疫原性组合物，其中该th-2诱导性细胞因子选自ifn-γ、il-4、il-5、il-6、il-10和il-13。[0190][134]如段落[127]所述的免疫原性组合物，其中该趋化因子选自mcp-1、mip-1α、mip-1β、rantes和tca-3。[0191][135]如段落[134]所述的免疫原性组合物，其中该共刺激分子选自cd80、cd86、cd40-l、cd70和cd27。[0192][136]如段落[127]所述的免疫原性组合物，其中该先天性免疫刺激剂选自sting(例如，casting)、tlr3、tlr4、tlr9、tlr7、tlr8、tlr7、rig-i/ddx58和mda-5/ifih1。[0193][137]如段落[136]所述的免疫原性组合物，其中该先天性免疫刺激剂是组成型活性突变体。[0194][138]如段落[127]所述的免疫原性组合物，其中该信号传导分子选自sting(例如，casting)、trif、tram、myd88、ips1、asc、mavs、mapk、ikk-α、ikk复合物、tbk1、b-连环蛋白和半胱天冬酶1。[0195][139]如段落[127]所述的免疫原性组合物，其中该转录激活因子选自ap1、nf-κb、irf3、irf7、irf1和irf5。[0196][140]如段落[127]所述的免疫原性组合物，其中该细胞因子受体选自il-2βr、ifn-γr和il-6r。[0197][141]如段落[127]所述的免疫原性组合物，其中该细菌组分选自鞭毛蛋白和mbl。[0198][142]如段落[125]至[141]中任一项所述的免疫原性组合物，其中该多肽免疫原和该佐剂各自与ires可操作地连接。[0199][143]如段落[125]所述的免疫原性组合物，其中作为先天性免疫系统刺激剂的该序列是富含gu的基序、富含au的基序、包含dsrna的结构化区域、或适体。[0200][144]如段落[1]至[143]中任一项所述的免疫原性组合物其中该环状多核糖核苷酸包含具有5'末端和3'末端的第一多核糖核苷酸，其中5'末端和3'末端各自与第二核糖核苷酸杂交，由此连接第一多核糖核苷酸的5'末端和3'末端以形成环状多核糖核苷酸。[0201][145]如段落[1]至[144]所述的环状多核糖核苷酸，其中该环状多核糖核苷酸通过夹板连接产生。[0202][146]如段落[1]至[143]中任一项所述的免疫原性组合物，其中通过提供具有3'末端和5'末端的线性多核糖核苷酸来产生该环状多核糖核苷酸，其中该3'末端和该5'末端各自包含内含子的一部分，并且其中该3'末端的内含子部分和该5'末端的内含子部分催化剪接反应，从而使该5'末端和该3'末端共价缀合以产生该环状多核糖核苷酸。[0203][147]如段落[146]所述的免疫原性组合物，其中该内含子是i类自剪接内含子。[0204][148]一种环状多核糖核苷酸的药物制剂，其中该环状多核糖核苷酸包含编码多肽免疫原的序列，并且其中该环状多核糖核苷酸占该药物制剂中总核糖核苷酸分子的至少25％(w/w)。[0205][149]如段落[148]所述的药物制剂，其中该环状多核糖核苷酸占药物制剂中总核糖核苷酸分子的至少30％(w/w)、40％(w/w)、50％(w/w)、60％(w/w)、70％(w/w)、75％(w/w)、80％(w/w)、85％(w/w)、90％(w/w)、91％(w/w)、92％(w/w)、93％(w/w)、94％(w/w)、95％(w/w)、96％(w/w)、97％(w/w)、98％(w/w)或99％(w/w)。[0206][150]如段落[148]或[149]中任一项所述的药物制剂，其中该药物制剂包含不超过该药物制剂中总核糖核苷酸分子的75％(w/w)、60％(w/w)、50％(w/w)、40％(w/w)、30％(w/w)、20％(w/w)、15％(w/w)、10％(w/w)、5％(w/w)或1％(w/w)的线性多核糖核苷酸分子。[0207][151]如段落[150]所述的药物制剂，其中该药物制剂包含不超过该药物制剂中总核糖核苷酸分子的0.5％(w/w)的线性多核糖核苷酸分子。[0208][152]如段落[148]至[151]中任一项所述的药物制剂，其中该制剂包含不超过该药物制剂中总核糖核苷酸分子的15％(w/w)的带切口的多核糖核苷酸分子。[0209][153]如段落[148]至[152]中任一项所述的药物制剂，其中该制剂包含不超过该药物制剂中总核糖核苷酸分子的10％(w/w)、9％(w/w)、8％(w/w)、7％(w/w)、6％(w/w)、5％(w/w)、4％(w/w)、3％(w/w)、2％(w/w)、1％(w/w)或0.5％(w/w)的带切口的多核糖核苷酸分子。[0210][154]如段落[148]或[149]中任一项所述的药物制剂，其中该药物制剂包含至少1％(w/w)的线性多核糖核苷酸。[0211][155]如段落[154]所述的药物组合物，其中该药物制剂包含30％-40％(w/w)的环状多核糖核苷酸和1％-10％(w/w)、10％-20％(w/w)、20％-30％(w/w)、30％-40％(w/w)、40％-50％(w/w)、50％-60％(w/w)或60％-70％(w/w)的线性多核糖核苷酸。[0212][156]。如段落[154]所述的药物组合物，其中该药物制剂包含40％-60％(w/w)的环状多核糖核苷酸和1％-10％(w/w)、10％-20％(w/w)、20％-30％(w/w)、30％-40％(w/w)、40％-50％(w/w)、50％-60％(w/w)的线性多核糖核苷酸。[0213][157]如段落[154]所述的药物组合物，其中该药物制剂包含60％-80％(w/w)的环状多核糖核苷酸和1％-10％(w/w)、10％-20％(w/w)、20％-30％(w/w)、30％-40％(w/w)的线性多核糖核苷酸。[0214][158]一种环状多核糖核苷酸的药物制剂，其中该环状多核糖核苷酸包含编码多肽免疫原的序列，并且其中该药物制剂包含不超过该药物制剂中总核糖核苷酸分子的75％(w/w)的线性多核糖核苷酸分子。[0215][159]如段落[158]所述的药物制剂，其中该药物制剂包含不超过该药物制剂中总核糖核苷酸分子的60％(w/w)、50％(w/w)、40％(w/w)、30％(w/w)、20％(w/w)、15％(w/w)、10％(w/w)、5％(w/w)、1％(w/w)或0.5％(w/w)的线性多核糖核苷酸分子。[0216][160]如段落[158]或[159]所述的药物制剂，其中该制剂包含不超过该药物制剂中总核糖核苷酸分子的15％(w/w)的带切口的多核糖核苷酸分子。[0217][161]如段落[158]至[160]中任一项所述的药物制剂，其中该制剂包含不超过该药物制剂中总核糖核苷酸分子的10％(w/w)、9％(w/w)、8％(w/w)、7％(w/w)、6％(w/w)、5％(w/w)、4％(w/w)、3％(w/w)、2％(w/w)、1％(w/w)或0.5％(w/w)的带切口的多核糖核苷酸分子。[0218][162]一种环状多核糖核苷酸的药物制剂，其中该环状多核糖核苷酸包含编码多肽免疫原的序列，并且其中该药物制剂包含不超过该药物制剂中总核糖核苷酸分子的15％(w/w)的带切口的多核糖核苷酸分子。[0219][163]如段落[162]所述的药物制剂，其中该制剂包含不超过该药物制剂中总核糖核苷酸分子的10％(w/w)、9％(w/w)、8％(w/w)、7％(w/w)、6％(w/w)、5％(w/w)、4％(w/w)、3％(w/w)、2％(w/w)、1％(w/w)或0.5％(w/w)的带切口的多核糖核苷酸分子。[0220][164]如段落[148]至[163]中任一项所述的药物制剂，其中如通过鲎变形细胞裂解物测试所测量，该药物制剂包含少于10eu/kg的内毒素或缺少内毒素。[0221][165]如段落[148]至[163]中任一项所述的药物制剂，其中该药物制剂在灭菌之前包含少于100cfu/100ml或少于10cfu/100ml的生物负荷。[0222][166]如段落[148]至[165]中任一项所述的药物制剂，其中该药物制剂是无菌药物制剂，例如在无菌条件下所测试支持少于100个活微生物的生长。[0223][167]如段落[148]至[166]中任一项所述的药物制剂，其中该药物制剂符合usp《71》的标准。[0224][168]如段落[148]至[67]中任一项所述的药物制剂，其中该药物制剂符合usp《85》的标准。[0225][169]如段落[148]至[168]中任一项所述的药物制剂，其中该药物制剂是最终成品药的中间体药物制剂。[0226][170]如段落[148]至[169]中任一项所述的药物制剂，其中该药物制剂是用于施用至受试者的最终成品药。[0227][171]如段落[148]至[170]中任一项所述的药物制剂，其中该药物制剂包含浓度为至少0.1ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、500μg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、100mg/ml、200mg/ml或500mg/ml的环状多核糖核苷酸分子。[0228][172]如段落[148]至[171]中任一项所述的药物制剂，其中该药物制剂包含不超过1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、1000μg/ml、5000μg/ml、10,000μg/ml、或100,000μg/ml的脱氧核糖核苷酸分子。[0229][173]如段落[148]至[172]中任一项所述的药物制剂，其中该药物制剂包含少于0.1ng、1ng、5ng、10ng、15ng、20ng、25ng、30ng、35ng、40ng、50ng、60ng、70ng、80ng、90ng、100ng、200ng、300ng、400ng、或500ng蛋白质污染物/毫克(mg)环状多核糖核苷酸分子的蛋白质污染物(例如酶)。[0230][174]如段落[148]至[173]中任一项所述的药物制剂，其中该药物制剂包含如通过分光光度计测量的约1.6至2.3的a260/a280吸光度比。[0231][175]如段落[148]至[174]中任一项所述的药物制剂，其中该药物制剂基本上不含选自以下项的工艺相关杂质：细胞蛋白质、细胞脱氧核糖核酸、酶、试剂组分、凝胶组分、或色谱材料。[0232][176]如段落[148]至[175]中任一项所述的药物制剂，其中该药物制剂在纯化之后与纯化之前相比具有降低水平的免疫或炎性反应的一种或多种标记物。[0233][177]如段落[148]至[176]中任一项所述的药物制剂，其中该环状多核糖核苷酸是段落[1]至[108]中任一项所述的环状多核糖核苷酸。[0234][178]如段落[148]至[177]中任一项所述的药物制剂，其中该环状多核糖核苷酸根据包括以下步骤的方法产生：[0235](a)提供多个线性多核糖核苷酸分子；[0236]b)使这些线性多核糖核苷酸分子环化以提供环状多核糖核苷酸分子的制剂；以及[0237]c)处理该制剂以从该制剂中去除线性多核糖核苷酸分子。[0238][179]如段落[178]所述的药物制剂，其中该方法进一步包括d)评价该制剂中在该处理步骤之后剩余的线性多核糖核苷酸分子的量。[0239][180]如段落[178]或[179]所述的药物制剂，其中该方法进一步包括e)进一步处理该制剂，其中进一步处理包括：[0240]-处理该制剂以从该制剂中去除带切口的多核糖核苷酸分子；和/或[0241]-处理该制剂以从该制剂中去除脱氧核糖核苷酸分子；和/或[0242]-处理该制剂以从该制剂中去除蛋白质污染物；和/或[0243]-处理该制剂以从该制剂中去除内毒素。[0244][181]一种药物组合物，该药物组合物包含如段落[1]至[108]中任一项所述的环状多核糖核苷酸，如段落[109]至[147]中任一项所述的免疫原性组合物，或如段落[148]至[180]中任一项所述的药物制剂以及药学上可接受的赋形剂。[0245][182]如段落[181]所述的药物组合物，该药物组合物进一步包含佐剂。[0246][183]如段落[182]所述的药物组合物，其中该佐剂是无机佐剂、小分子佐剂和水包油乳剂、脂质或聚合物、肽或肽聚糖、碳水化合物或多糖、皂苷、基于rna的佐剂、基于dna的佐剂、病毒颗粒、细菌佐剂、杂交分子、真菌或卵母细胞微生物相关分子模式(mamp)、无机纳米颗粒或多组分佐剂。[0247][184]如段落[183]所述的药物组合物，其中该佐剂是无机佐剂。[0248][185]如段落[184]所述的药物组合物，其中该无机佐剂是铝盐或钙盐。[0249][186]如段落[183]所述的药物组合物，其中该佐剂是小分子。[0250][187]如段落[183]所述的药物组合物，其中该小分子是咪喹莫特、瑞喹莫德或嘎葡聚糖。[0273][210]如段落[183]所述的药物组合物，其中该佐剂是无机纳米颗粒。[0274][211]如段落[210]所述的药物组合物，其中该无机纳米颗粒是金纳米棒、基于二氧化硅的纳米颗粒，任选地是介孔二氧化硅纳米颗粒(msn)。[0275][212]如段落[183]所述的药物组合物，其中该佐剂是多组分佐剂。[0276][213]如段落[212]所述的药物组合物，其中该多组分佐剂是as01、as03、as04、完全弗氏佐剂或caf01。[0277][214]一种包含混合物的药物组合物，该混合物包含(a)包含编码多肽免疫原的序列的多核糖核苷酸和(b)醇，其中该醇占该混合物的约0.3％v/v至约75％v/v。[0278][215]如段落[214]所述的药物组合物，其中该多核糖核苷酸是环状多核糖核苷酸。[0279][216]一种包含混合物的药物组合物，该混合物包含(a)如段落[1]至[108]中任一项所述的环状多核糖核苷酸，如段落[109]至[147]中任一项所述的免疫原性组合物，或如段落[148]至[180]中任一项所述的药物制剂，和(b)醇，其中该醇占该混合物的约0.3％v/v至约75％v/v。[0280][217]如段落[214]所述的药物组合物，其中该多核糖核苷酸是线性多核糖核苷酸。[0281][218]如段落[217]所述的药物组合物，其中该线性多核糖核苷酸包含多个序列，每个序列编码多肽免疫原，其中这些多肽免疫原中的至少两种具有至少90％的氨基酸序列同一性。[0282][219]如段落[218]所述的药物组合物，其中该至少两种多肽免疫原具有小于100％的氨基酸序列同一性。[0283][220]如段落[217]所述的药物组合物，其中该线性多核糖核苷酸包含多个序列，每个序列编码多肽免疫原，其中这些多肽免疫原中的至少两种鉴别不同的蛋白质，其中这些不同的蛋白质中的每一种鉴别相同的靶标。[0284][221]如段落[217]所述的药物组合物，其中该线性多核糖核苷酸包含多个序列，每个序列编码多肽免疫原，其中这些多肽免疫原中的至少两种鉴别不同的靶标。[0285][222]如段落[217]至[221]中任一项所述的药物组合物，其中该线性多核糖核苷酸包含至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个或至少九个序列，每个序列编码多肽免疫原。[0286][223]如段落[215]所述的药物组合物，其中该环状多核糖核苷酸进一步包含至少一个编码佐剂的序列。[0287][224]如段落[223]所述的药物组合物，其中该佐剂是多肽。[0288][225]如段落[224]所述的药物组合物，其中该佐剂是细胞因子、趋化因子、共刺激分子、先天性免疫刺激剂、信号传导分子、转录激活因子、细胞因子受体、细菌组分或先天性免疫系统的组分。[0289][226]如段落[215]或[223]至[225]中任一项所述的药物组合物，其中该环状多核糖核苷酸进一步包含作为先天性免疫系统刺激剂的序列。[0290][227]如段落[226]所述的药物组合物，其中作为先天性免疫系统刺激剂的该序列是富含gu的基序、富含au的基序、包含dsrna的结构化区域、或适体。[0291][228]如段落[214]至[227]中任一项所述的药物组合物，其中该醇占该混合物的约0.3％v/v至约60％v/v、约0.3％v/v至约50％v/v、约0.3％v/v至约40％v/v、约0.3％v/v至约20％v/v、约0.3％v/v至约15％v/v、约0.3％v/v至约10％v/v、约0.3％v/v至约5％v/v、约0.3％v/v至约1％v/v或约0.3％v/v至约0.5％v/v。[0292][229]如段落[214]至[227]中任一项所述的药物组合物，其中该醇占该混合物的约0.5％v/v至约75％v/v、约1％v/v至约75％v/v、约5％v/v至约75％v/v、约10％v/v至约75％v/v、约15％v/v至约75％v/v、约20％v/v至约75％v/v、约30％v/v至约75％v/v、约40％v/v至约75％v/v、约50％v/v至约75％v/v、约60％v/v至约75％v/v、或约70％v/v至约75％v/v。[0293][230]如段落[214]至[229]中任一项所述的方法，其中该醇选自甲醇、乙醇、异丙醇、苯氧乙醇、三乙醇胺、苯乙醇、丁醇、戊醇、鲸蜡醇、乙二醇、丙二醇、变性醇、苯甲醇(特别是变性醇)、二醇、硬脂醇、鲸蜡硬脂醇、薄荷醇、聚乙二醇(peg)-400、乙氧基化脂肪酸和羟乙基纤维素。[0294][231]如段落[230]所述的方法，其中该醇是乙醇。[0295][232]如段落[214]至[231]中任一项所述的药物组合物，其中该药物组合物被配制用于局部施用。[0296][233]如段落[214]至[232]中任一项所述的药物组合物，其中该药物组合物是液体、凝胶、润肤露、糊剂、乳膏、泡沫或棒。[0297][234]如段落[214]至[233]中任一项所述的药物组合物，其中该药物组合物具有约6-8的ph。[0298][235]如段落[214]至[234]中任一项所述的药物组合物，其中该药物组合物具有与水大致相同的粘度。[0299][236]如段落[214]至[235]中任一项所述的药物组合物，其中该药物组合物基本上不含疏水性或亲脂性基团。[0300][237]如段落[214]至[236]中任一项所述的药物组合物，其中该药物组合物基本上不含烃。[0301][238]如段落[214]至[237]中任一项所述的药物组合物，其中该药物组合物基本上不含阳离子脂质体。[0302][239]如段落[214]至[238]中任一项所述的药物组合物，其中该药物组合物基本上不含脂肪酸、脂质、脂质体、胆固醇或其任何组合。[0303][240]如段落[214]至[239]中任一项所述的药物组合物，该组合物进一步包含佐剂。[0304][241]如段落[240]所述的药物组合物，其中该佐剂是无机佐剂、小分子佐剂和水包油乳剂、脂质或聚合物、肽或肽聚糖、碳水化合物或多糖、皂苷、基于rna的佐剂、基于dna的佐剂、病毒颗粒、细菌佐剂、杂交分子、真菌或卵母细胞微生物相关分子模式(mamp)、无机纳米颗粒或多组分佐剂。[0305][242]一种向受试者递送多核糖核苷酸的方法，该方法包括将如段落[214]至[241]中任一项所述的药物组合物局部施加至该受试者的表面区域。[0306][243]一种将多核糖核苷酸递送至受试者的方法，该方法包括：[0307]a)将灭菌剂施加至该受试者的表面区域；以及[0308]b)将包含如段落[1]至[108]中任一项所述的环状多核糖核苷酸，如段落[109]至[147]中任一项所述的免疫原性组合物，如段落[148]至[180]中任一项所述的药物制剂或如段落[181]至[242]中任一项所述的药物组合物和稀释剂的组合物施加至该受试者的表面区域。[0309][244]如段落[243]所述的方法，其中(b)的组合物不包含载剂。[0310][245]如段落[243]或[244]所述的方法，其中该灭菌剂是醇、紫外光、激光或热。[0311][246]一种将多核糖核苷酸递送至受试者的方法，该方法包括[0312]a)将醇施加至该受试者的表面区域；以及[0313]b)将包含如段落[1]至[108]中任一项所述的环状多核糖核苷酸，如段落[109]至[147]中任一项所述的免疫原性组合物，如段落[148]至[180]中任一项所述的药物制剂或如段落[181]至[241]中任一项所述的药物组合物和稀释剂的组合物施加至该受试者的表面区域。[0314][247]如段落[246]所述的方法，其中该醇选自由以下组成的组：甲醇、乙醇、异丙醇、苯氧乙醇、三乙醇胺、苯乙醇、丁醇、戊醇、鲸蜡醇、乙二醇、丙二醇、变性醇、苯甲醇(特别是变性醇)、二醇、硬脂醇、鲸蜡硬脂醇、薄荷醇、聚乙二醇(peg)-400、乙氧基化脂肪酸和羟乙基纤维素。[0315][248]如段落[247]所述的方法，其中该醇是乙醇。[0316][249]如段落[243]至[248]中任一项所述的方法，其中该受试者的表面区域选自皮肤、口腔、鼻腔、胃肠道、呼吸道或其任何组合的表面区域。[0317][250]一种脂质纳米颗粒(lnp)，该脂质纳米颗粒包含如段落[1]至[108]中任一项所述的环状多核糖核苷酸或如段落[109]至[147]中任一项所述的免疫原性组合物。[0318][251]如段落[250]所述的lnp，该lnp包含可电离脂质。[0319][252]如段落[250]所述的lnp，该lnp包含阳离子脂质。[0320][253]如段落[252]所述的lnp，其中该阳离子脂质具有根据以下的结构：[0321][0322][254]如段落[250]至[253]中任一项所述的lnp，该lnp进一步包含一种或多种中性脂质，例如dspc、dppc、dmpc、dopc、popc、dope、sm，类固醇，例如胆固醇，和/或一种或多种聚合物缀合的脂质，例如聚乙二醇化脂质，例如peg-dag、peg-pe、peg-s-dag、peg-cer或peg二烷氧基丙基氨基甲酸酯。[0323][255]一种治疗或预防受试者中的疾病、病症或病状的方法，该方法包括向该受试者施用如段落[1]至[108]中任一项所述的环状多核糖核苷酸，如段落[109]至[147]中任一项所述的免疫原性组合物，如段落[148]至[180]中任一项所述的药物制剂，如段落[181]至[241]中任一项所述的药物组合物，或如段落[250]至[254]中任一项所述的lnp。[0324][256]如段落[255]所述的方法，其中该疾病、病症或病状是病毒感染、细菌感染或真菌感染。[0325][257]如段落[255]所述的方法，其中该疾病、病症或病状是癌症。[0326][258]如段落[255]所述的方法，其中该疾病、病症或病状与暴露于过敏原相关。[0327][259]如段落[255]所述的方法，其中该疾病、病症或病状与暴露于毒素相关。[0328][260]一种在受试者中诱导免疫反应的方法，该方法包括向该受试者施用如段落[1]至[108]中任一项所述的环状多核糖核苷酸，如段落[109]至[147]中任一项所述的免疫原性组合物，如段落[148]至[180]中任一项所述的药物制剂，如段落[181]至[241]中任一项所述的药物组合物，或如段落[250]至[254]中任一项所述的lnp。[0329][261]如段落[255]至[260]中任一项所述的方法，其中该受试者是哺乳动物。[0330][262]如段落[261]所述的方法，其中该受试者是人。[0331][263]如段落[261]所述的方法，其中该方法是非人哺乳动物。[0332][264]如段落[261]所述的方法，其中该非人哺乳动物是牛、绵羊、山羊、猪、狗、马或猫。[0333][265]如段落[255]至[264]中任一项所述的方法，其中该受试者是鸟。[0334][266]如段落[265]所述的方法，其中该鸟是母鸡、公鸡、火鸡或鹦鹉。[0335][267]如段落[255]至[266]中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括向该受试者施用佐剂。[0336][268]如段落[267]所述的方法，其中该佐剂是无机佐剂、小分子佐剂和水包油乳剂、脂质或聚合物、肽或肽聚糖、碳水化合物或多糖、皂苷、基于rna的佐剂、基于dna的佐剂、病毒颗粒、细菌佐剂、杂交分子、真菌或卵母细胞微生物相关分子模式(mamp)、无机纳米颗粒或多组分佐剂。[0337][269]如段落[267]所述的方法，其中该佐剂是多肽佐剂。[0338][270]如段落[269]所述的方法，其中该多肽佐剂是细胞因子、趋化因子、共刺激分子、先天性免疫刺激剂、信号传导分子、转录激活因子、细胞因子受体、细菌组分或先天性免疫系统的组分。[0339][271]如段落[267]所述的方法，其中该佐剂是先天性免疫系统刺激剂。[0340][272]如段落[271]所述的方法，其中该先天性免疫系统刺激剂选自包括富含gu的基序、富含au的基序、包含dsrna的结构化区域、或适体的rna。[0341][273]如段落[255]至[272]中任一项所述的方法，其中如段落[1]至[110]中任一项所述的环状多核糖核苷酸，如段落[111]至[151]中任一项所述的免疫原性组合物，如段落[152]至[184]中任一项所述的药物制剂，如段落[185]至[245]中任一项所述的药物组合物，或如段落[250]至[254]中任一项所述的lnp以单剂量的形式施用给该受试者。[0342][274]如段落[255]至[272]中任一项所述的方法，其中如段落[1]至[108]中任一项所述的环状多核糖核苷酸，如段落[109]至[147]中任一项所述的免疫原性组合物，如段落[148]至[180]中任一项所述的药物制剂，如段落[181]至[241]中任一项所述的药物组合物，或如段落[250]至[254]中任一项所述的lnp向该受试者施用两次或更多次、三次或更多次、四次或更多次、或五次或更多次。[0343][275]如段落[274]所述的方法，其中如段落[1]至[108]中任一项所述的环状多核糖核苷酸，如段落[109]至[147]中任一项所述的免疫原性组合物，如段落[148]至[180]中任一项所述的药物制剂，如段落[181]至[241]中任一项所述的药物组合物，或如段落[250]至[254]中任一项所述的lnp的施用约每周、约每两周、约每三周、约每个月、约每两个月、约每三个月、约每四个月、约每五个月、约每六个月、约每年、约每两年、约每三年、约每四年、约每五年或约每十年发生一次。[0344][276]如段落[255]至[275]中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括向受试者施用多肽免疫原(例如，包含多肽免疫原的蛋白质亚基)。[0345][277]如段落[276]所述的方法，其中该多肽免疫原对应于由环状多核糖核苷酸序列编码的多肽免疫原(例如，与之具有90％、95％、96％、97％、98％或100％的氨基酸序列同一性。[0346][278]如段落[276]所述的方法，其中在施用如段落[1]至[108]中任一项所述的环状多核糖核苷酸，如段落[109]至[147]中任一项所述的免疫原性组合物，如段落[148]至[180]中任一项所述的药物制剂，如段落[181]至[241]中任一项所述的药物组合物，或如段落[250]至[254]中任一项所述的lnp之后，向该受试者施用该多肽免疫原。[0347][279]如段落[276]至[278]中任一项所述的方法，其中该多肽免疫原维持或增强该受试者针对该多肽免疫原的免疫反应。[0348][280]一种维持或增强受试者中的免疫反应的方法，该方法包括(i)向该受试者施用编码多肽免疫原的环状多核糖核苷酸并且(ii)向该受试者施用该多肽免疫原，其中步骤(ii)发生在步骤(i)之后的1周至6个月之间，并且其中步骤(ii)的该多肽免疫原的施用维持或增强该受试者针对该多肽免疫原的免疫反应。[0349][281]如段落[280]所述的方法，其中该多肽免疫原包含一个或多个鉴别靶标的表位。[0350][282]如段落[281]所述的方法，其中该靶标是病原体。[0351][283]如段落[281]所述的方法，其中该靶标是癌细胞、过敏原或毒素。[0352]定义[0353]本披露将针对特定实施例并参考某些附图进行描述，但是本披露不限于此，而是仅由权利要求书来限定。除非另有说明，否则下文陈述的术语通常应以其共识来理解。[0354]如本文所用，术语“适应性免疫反应”是指体液或细胞介导的免疫反应。为了本披露的目的，“体液免疫反应”是指由抗体分子介导的免疫反应，而“细胞免疫反应”是由t淋巴细胞和/或其他白细胞介导的免疫反应。[0355]如本文所用，术语“佐剂”是指增加免疫反应，例如增加针对免疫原的特异性免疫反应的组合物(例如化合物、多肽、核酸或脂质)。增加免疫反应包括强化或扩大抗体和细胞免疫反应中的任一者或两者的特异性。[0356]术语“醇”意指其中羟基官能团(-oh)与碳结合的任何有机化合物。在一些实施例中，醇包括与饱和碳键合的羟基，该饱和碳又与其他氢或碳原子键合。如本文所述的醇可以包括但不限于一元醇、多元醇、不饱和脂族醇和脂环族醇。在一些情况下，醇可以指乙醇。在一些情况下，醇可以包括但不限于甲醇、乙醇、异丙醇、苯氧乙醇、三乙醇胺、苯乙醇、丁醇、戊醇、鲸蜡醇、乙二醇、丙二醇、变性醇、苯甲醇(特别是变性醇)、二醇、硬脂醇、鲸蜡硬脂醇、薄荷醇、聚乙二醇(peg)-400、乙氧基化脂肪酸和羟乙基纤维素。[0357]如本文所用，术语“与疾病、病症或病状相关”是指实体与受试者的疾病、病症或病状的发生或严重程度之间的因果关系或相关性关系。例如，如果靶标与疾病、病症或病状相关，则该靶标可以是该疾病、病症或病状的致病因子。例如，病毒可以是病毒感染的致病因子，细菌可以是细菌感染的致病因子，真菌可以是真菌感染的致病因子，或寄生虫可以是寄生虫感染的致病因子，癌细胞可以是癌症的致病因子，毒素可以是毒性的致病因子，或者过敏原可以是过敏反应的致病因子。与疾病、病症或病状相关的靶标还可以或替代性地与疾病、病症或病状发生的可能性增加或严重程度增加有关联。[0358]如本文所用，术语“载剂”意指利于将组合物(例如，线性或环状多核糖核苷酸)运输或递送到受试者、组织或细胞中的化合物、组合物、试剂或分子。载剂的非限制性实例包括碳水化合物载剂(例如，酸酐改性的植物糖原或糖原型材料)、纳米颗粒(例如，封装或共价连接结合至环状或线性多核糖核苷酸的纳米颗粒)、脂质体、融合体(fusosome)、离体分化的网织红细胞、外泌体、蛋白质载剂(例如，与多核糖核苷酸共价连接的蛋白质)或阳离子载剂(例如，阳离子脂聚合物或转染试剂)。[0359]如本文所用，术语“细胞穿透剂”意指当与细胞接触时利于进入细胞的试剂。在一些情况下，细胞穿透剂利于细胞膜的直接穿透，例如经由与细胞膜带负电荷的磷脂的直接静电相互作用，或通过诱导膜蛋白或磷脂双层的构型变化而引起的瞬时孔形成。在一些情况下，细胞穿透剂利于内吞作用介导的向细胞内的易位。例如，在某些情形下，细胞穿透剂可以刺激细胞经历内吞过程，由此细胞膜可以向内折叠到细胞中。在某些实施例中，细胞穿透剂有助于形成跨细胞膜转运的过渡结构。不希望受特定理论的束缚，如本文所提供的细胞穿透剂可以增加细胞膜的渗透性或增加分子进入细胞的内化，其结果是，与没有细胞穿透剂的其他相同递送相比，当细胞同时与细胞穿透剂接触时，可以更有效地递送到细胞中。[0360]如本文所用，术语“circrna”或“环状多核糖核苷酸”或“环状rna”或“环状多核糖核苷酸分子”可互换使用，并且意指具有没有游离端(即，没有游离3'和/或5'端)的结构的多核糖核苷酸分子，例如通过共价(例如，共价闭合)或非共价键形成环状或环形结构的多核糖核苷酸分子。[0361]如本文所用，术语“环化效率”是所得环状多核糖核苷酸相对于其非环状起始材料的测量。[0362]如本文所用，术语“circrna制剂”或“环状多核糖核苷酸制剂”或“环状rna制剂”可互换使用，并且意指包括circrna分子和稀释剂、载剂、第一佐剂或其组合的组合物。[0363]词语“用于治疗、调节等的化合物、组合物、产物等”应理解为是指本身适合于所指示的治疗、调节等目的的化合物、组合物、产物等。词语“用于治疗、调节等的化合物、组合物、产物等”另外作为一个优选实施例披露了此类化合物、组合物、产物等用于治疗、调节等。[0364]词语“用于…的化合物、组合物、产物等”或“化合物、组合物、产物等用于制造用以…的药物、药物组合物、兽用组合物、诊断组合物等的用途”表示这些化合物、组合物、产物等将用于可在人体或动物身上实施的治疗方法中。它们被认为是涉及治疗方法等的实施例和权利要求的等同披露。如果实施例或权利要求因此是指“用于治疗疑似患有疾病的人或动物的化合物”，则这也被认为是披露“化合物在制造用于治疗疑似患有疾病的人或动物的药物中的用途”或“通过向疑似患有疾病的人或动物施用化合物的治疗方法”。[0365]术语“稀释剂”意指包含非活性溶剂的媒介物，本文所述的组合物(例如，包含环状或线性多核糖核苷酸的组合物)可以稀释或溶解在其中。稀释剂可以是rna增溶剂、缓冲剂、等渗剂或其混合物。稀释剂可以是液体稀释剂或固体稀释剂。液体稀释剂的非限制性实例包括水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂(诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(尤其是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯以及1,3-丁二醇。固体稀释剂的非限制性实例包括碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉或糖粉。[0366]如本文所用，术语“疾病”、“病症”和“病状”各自指亚健康状态，例如，通常被或将会被医疗专业人员诊断或治疗的状态。[0367]如本文所用，术语“表位”是指被抗体或t细胞受体识别、靶向或结合的免疫原的一部分或全部。表位可以是线性表位，例如核酸或氨基酸的连续序列。表位可以是构象表位，例如，含有在蛋白质的折叠构象中形成表位的氨基酸的表位。构象表位可以含有来自一级氨基酸序列的非连续氨基酸。再如，构象表位包括基于其二级结构或三级结构在免疫原性序列的折叠构象中形成表位的核酸。[0368]如本文所用，术语“加密原(encryptogen)”是环状多核糖核苷酸的核酸序列或结构，该核酸序列或结构有助于减少、逃避和/或避免被免疫细胞检测到和/或减少针对环状或线性多核糖核苷酸的免疫反应的诱导。[0369]如本文所用，术语“表达序列”是编码产物，例如肽或多肽或调控核酸的核酸序列。编码肽或多肽的示例性表达序列可以包括多个核苷酸三联体，其中每一个都可以编码氨基酸，并被称为“密码子”。[0370]如本文所用，术语“鉴别”是指指示、建立或识别实体的同一性。例如，免疫原或其表位可以鉴别靶标，意指该靶标包括该免疫原或其表位，该免疫原或其表位源自该靶标，和/或该免疫原或其表位与该靶标的一部分或全部具有高度相似性。抗体或t细胞受体对免疫原或其表位的鉴别或结合可以鉴别靶标。当免疫原或其表位鉴别靶标时，该免疫原或其表位将靶标与一个或多个其他靶标区分开。同样，多肽免疫原可以鉴别蛋白质。换句话说，多肽免疫原是蛋白质的组分或蛋白质的一部分(尤其是蛋白质的表位)，源自蛋白质或蛋白质的一部分，或与蛋白质或蛋白质的一部分具有高度相似性。[0371]如本文所用，术语“先天性免疫系统刺激剂”是指部分地通过诱导参与先天性免疫的一个或多个基因的表达来诱导先天性免疫反应的物质，这些基因包括但不限于i型干扰素(例如，ifnα、infβ和/或ifnγ)、促炎性细胞因子(例如，il-1、il-12、il-18、tnf-α和/或gm-csf)、视黄酸诱导型基因-i(rig-i，也称为ddx58)、黑色素瘤分化相关基因5(mda5，也称为ifih1)、2'-5'寡腺苷酸合酶1(oas1)、oas样蛋白(oasl)和/或蛋白激酶r(pkr)。先天性免疫系统刺激剂可充当佐剂，例如当与编码免疫原的核糖核苷酸组合施用或一起配制时。先天性免疫系统刺激剂可以是单独的分子实体(例如，不是由多核糖核苷酸编码或作为序列并入多核糖核苷酸中的)，例如sting(例如，casting)、tlr3、tlr4、tlr9、tlr7、tlr8、tlr7、rig-i/ddx58和mda-5/ifih1或其组成型活性突变体。先天性免疫系统刺激剂可由多核糖核苷酸编码(例如，由多核糖核苷酸表达)。多核糖核苷酸可以替代性地或进一步包含充当先天性免疫系统刺激剂的核糖核苷酸序列(例如，富含gu的基序、富含au的基序、包含dsrna的结构化区域、或适体)。[0372]如本文所用，术语“杂质”是存在于组合物中，例如如本文所述的药物组合物中的不需要的物质。在一些实施例中，杂质是与工艺有关的杂质。在一些实施例中，杂质是最终组合物中除所需产物以外，例如除如本文所述的活性药物成分(例如，环状或线性多核糖核苷酸)以外与产物有关的物质。如本文所用，术语“与工艺有关的杂质”是在最终的组合物、制剂或产物中，除本文所述的线性多核糖核苷酸以外，在组合物、制剂或产物的制造中使用、存在或生成的不需要的物质。在一些实施例中，与工艺有关的杂质是在多核糖核苷酸的合成或环化中使用的酶。如本文所用，术语“与产物有关的物质”是在组合物、制剂或产物或其任何中间体的合成过程中产生的物质或副产物。在一些实施例中，与产物有关的物质是脱氧核糖核苷酸片段。在一些实施例中，与产物有关的物质是脱氧核糖核苷酸单体。在一些实施例中，与产物有关的物质是以下的一种或多种：本文所述的多核糖核苷酸的衍生物或片段，例如10、9、8、7、6、5或4个核糖核酸、单核糖核酸、二核糖核酸或三核糖核酸的片段。[0373]如本文所用，术语“免疫原”是指包括一个或多个被抗体或t细胞受体识别、靶向或结合的表位的任何分子或分子结构。特别地，免疫原在受试者中诱导免疫反应(例如，如本文所定义的那样具有免疫原性)。免疫原能够在受试者中诱导免疫反应，其中该免疫反应是指当免疫原遇到免疫系统时诱导的一系列分子、细胞和生物事件。免疫反应可以是体液和/或细胞免疫反应。这些可以包括抗体的产生以及b细胞和t细胞的扩增。为了确定是否已经发生免疫反应并跟踪其进程，可以监测免疫受试者针对特定免疫原的免疫反应物的出现。对大多数免疫原的免疫反应诱导特异性抗体和特异性效应t细胞的产生。在一些实施例中，免疫原是宿主外源的。在一些实施例中，免疫原不是宿主外源的。免疫原可以包括多肽、多糖、多核苷酸或脂质的全部或一部分。免疫原也可以是混合的多肽、多糖、多核苷酸和/或脂质。例如，免疫原可以是已经翻译修饰的多肽。“多肽免疫原”是指包括多肽的免疫原。多肽免疫原还可以包括一个或多个翻译后修饰，和/或可以与一个或多个其他分子形成复合物，和/或可以呈三级或四级结构，每种结构可以决定或影响多肽的免疫原性。[0374]如本文所用，术语“免疫原性”是在特定的免疫反应测定中诱导超过预定阈值的对物质的反应的潜力。该测定可以是例如某些炎症标志物的表达、抗体的产生或如本文所述的免疫原性的测定。在一些实施例中，当生物体或某种类型的免疫细胞的免疫系统暴露于免疫原时，可以诱导免疫反应。[0375]可以使用总抗体测定法、确认试验、抗体的滴定和同种型分析以及中和抗体评估来评价受试者血浆或血清中的抗体，从而评估免疫原性反应。总抗体测定法测量在已经施用了免疫原的受试者的血清或血浆中作为免疫反应的一部分而生成的所有抗体。检测抗体最常用的试验是elisa(酶联免疫吸附测定)，检测受试血清中与目标抗体结合的抗体，包括igm、igd、igg、iga和ige。可通过确认测定法进一步评估免疫原性反应。在总抗体评估之后，可以使用确认测定法来确认总抗体测定法的结果。竞争测定法可用于确认抗体与靶标特异性结合，并且筛选测定法中的阳性发现不是试验血清或检测试剂与该测定法中其他物质发生非特异性相互作用的结果。[0376]可通过同种型分析和滴定来评估免疫原性反应。同种型测定可用于仅评估相关抗体的同种型。例如，预期的同种型可以是igm和igg，它们可以通过同种型分析和滴定进行特异性检测和定量，然后与存在的总抗体进行比较。[0377]可以通过中和抗体测定法(nab)来评估免疫原性反应。中和抗体测定法(nab)可用于确定响应于免疫原而产生的抗体是否中和免疫原，从而抑制免疫原对靶标产生作用并导致异常的药代动力学行为。nab测定法通常是基于细胞的测定法，其中靶细胞与抗体一起孵育。可以使用多种基于细胞的nab测定法，包括但不限于细胞增殖、活力、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)、，补体依赖性细胞毒性(cdc)、细胞病变效应抑制(cpe)、凋亡、配体刺激的细胞信号传导、酶活性、报告基因测定、蛋白质分泌、代谢活性、应激和线粒体功能。检测读数包括吸光度、荧光、发光、化学发光或流式细胞术读数。配体结合测定法还可用于体外测量免疫原和抗体的结合亲和力，以评价中和功效。[0378]此外，可以通过使用从受试者获得的t细胞上的细胞标志物测量受试者中的t细胞活化来评估细胞免疫反应的诱导。可以从受试者收集血液样品、淋巴结活检样品或组织样品，并评价来自样品的t细胞中的以下一种或多种(例如，2、3、4种或更多种)活化标志物：cd25、cd71、cd26、cd27、cd28、cd30、cd154、cd40l、cd134、cd69、cd62l或cd44。也可以在体内动物模型中使用相同的方法评估t细胞活化。也可以通过向体外t细胞(例如，从受试者、动物模型、储库或商业来源获得的t细胞)添加免疫原并测量上述标志物来进行该测定以评估t细胞活化。可以使用类似方法评估对其他免疫细胞(诸如嗜酸性细胞(标志物：cd35、cd11b、cd66、cd69和cd81))、树突细胞(标志物：il-8、mhcii类、cd40、cd80、cd83和cd86)、嗜碱性细胞(cd63、cd13、cd4和cd203c)和中性粒细胞(cd11b、cd35、cd66b和cd63)的活化的影响。可以使用流式细胞术、免疫组织化学、原位杂交和其他允许测量细胞标志物的测定法来评估这些标志物。免疫原施用前后的比较结果可用于确定其影响。[0379]如本文所用，术语“诱导免疫反应”是指引发、放大或维持受试者的免疫反应。诱导免疫反应可以指适应性免疫反应或先天性免疫反应。免疫反应的诱导可以如上所讨论的那样进行测量。[0380]如本文所用，术语“线性对应物”是具有与环状多核糖核苷酸相同或相似的核苷酸序列(例如，100％、95％、90％、85％、80％、75％或之间的任何百分比的序列同一性)并且具有两个游离末端(即，环状多核糖核苷酸的未环化形式(及其片段))的多核糖核苷酸分子(及其片段)。在一些实施例中，线性对应物(例如，环化前形式)是具有与环状多核糖核苷酸相同或相似的核苷酸序列(例如，100％、95％、90％、85％、80％、75％或之间的任何百分比的序列同一性)和相同或相似的核酸修饰并且具有两个游离末端(即，环状多核糖核苷酸的未环化形式(及其片段))的多核糖核苷酸分子(及其片段)。在一些实施例中，线性对应物是具有与环状多核糖核苷酸相同或相似的核苷酸序列(例如，100％、95％、90％、85％、80％、75％或之间的任何百分比的序列同一性)和不同的核酸修饰或没有核酸修饰并且具有两个游离末端(即，环状多核糖核苷酸的未环化形式(及其片段))的多核糖核苷酸分子(及其片段)。在一些实施例中，作为线性对应物的多核糖核苷酸分子的片段是线性对应物多核糖核苷酸分子的比该线性对应物多核糖核苷酸分子短的任何部分。在一些实施例中，线性对应物进一步包括5’帽。在一些实施例中，线性对应物进一步包括聚腺苷尾。在一些实施例中，线性对应物进一步包括3’utr。在一些实施例中，线性对应物进一步包括5’utr。[0381]如本文所用，术语“线性rna”或“线性多核糖核苷酸”或“线性多核糖核苷酸分子”可互换使用并且意指具有5'末端和3’末端的多核糖核苷酸分子。5'末端和3’末端中的一个或两个可以是游离末端或者可以与另一部分连接。线性rna包括尚未经历环化(例如，环化前)的rna，并且可以用作起始材料通过例如夹板连接或化学、酶促、核酶或剪接催化的环化方法进行环化。[0382]如本文所用，术语“混合物”意指由两种或更多种不同物质混合而成的材料。在一些情况下，本文所述的混合物可以是两种或更多种不同物质的均匀混合物，例如，在混合物的任何给定样品中，混合物可以具有相同比例的组分(例如，两种或更多种物质)。在一些情况下，本文所提供的混合物可以是两种或更多种不同物质的不均匀混合物，例如，混合物组分(例如，两种或更多种物质)的比例在整个混合物中可以不同。在一些情况下，混合物是液体溶液，例如，混合物以液相存在。在一些情况下，可以将液体溶液视为包含液体溶剂和溶质。将溶质混合在液体溶剂中可以称为“溶解”过程。在一些情况下，液体溶液是液液溶液(例如，液体溶质溶解在液体溶剂中)，固液溶液(例如，固体溶质溶解在液体溶剂中)或气液溶液(例如，固体溶质溶解在液体溶剂中)。在一些情况下，存在一种以上的溶剂和/或一种以上的溶质。在一些情况下，混合物是胶体、液体悬浮液或乳液。在一些情况下，混合物是固体混合物，例如，混合物以固相存在。[0383]如本文所用，术语“经修饰的核糖核苷酸”意指具有至少一个针对糖、核碱基或核苷间键的修饰的核苷酸。[0384]如本文所用，术语“裸递送”意指无需借助于载剂而递送至细胞且没有对有助于递送至细胞的部分进行共价修饰的配制品。裸递送配制品不含任何转染试剂、阳离子载剂、碳水化合物载剂、纳米颗粒载剂或蛋白质载剂。例如，环状或线性多核糖核苷酸的裸递送配制品是包含没有共价修饰的环状或线性多核糖核苷酸且不含载剂的配制品。[0385]如本文所用，术语“带切口的rna”或“带切口的线性多核糖核苷酸”或“带切口的线性多核糖核苷酸分子”可以互换使用并且意指由于环状rna切口或降解而产生的具有5'末端和3’末端的多核糖核苷酸分子。[0386]如本文所用，术语“非环状rna”意指总的带切口的rna和线性rna。[0387]术语“通过……可获得”、“通过……可产生”或其他类似短语用于指示权利要求或实施例是指化合物、组合物、产物等本身，即该化合物、组合物、产物等可通过描述用于制造该化合物、组合物、产物等的方法获得或产生，但该化合物、组合物、产物等也可以通过该描述的方法以外的其他方法获得或产生。术语“通过……获得”、“通过……产生”或等等指示化合物、组合物、产物是通过所列举的具体方法获得或产生的。应理解，术语“通过……可获得”、“通过……可产生”等还披露了术语“通过……获得”、“通过……产生”等作为“通过……可获得”、“通过……可产生”等的优选实施例。[0388]如本文所用，术语“病原体”是指在受试者中引起疾病或疾病症状的感染因子，例如，通过直接感染受试者，通过产生在受试者中引起疾病或疾病症状的因子和/或通过在受试者中引发免疫反应。如本文所用，病原体包括但不限于细菌、原生动物、寄生生物、真菌、线虫、昆虫、类病毒和病毒、或其任何组合，其中每种病原体能够(自身或与另一种病原体共同)引发受试者的疾病或症状。[0389]如本文所用，术语“有效载荷”意指如本文所披露的由多核糖核苷酸递送的任何分子。在一些情况下，有效载荷是核酸、蛋白质、化学物质、核糖核蛋白或其任何组合。在一些情况下，有效载荷是如本文所披露的直接包含在多核糖核苷酸内的核酸序列。在一些情况下，有效载荷例如经由互补杂交或经由蛋白质-核酸相互作用与如本文所披露的多核糖核苷酸附接或缔合。在一些情况下，有效载荷是由包含在多核糖核苷酸中、与多核糖核苷酸附接或缔合的核酸序列编码的蛋白质。在一些情况下，“附接”意指两个分子之间的共价键或非共价相互作用。在一些情况下，当在有效载荷与多核糖核苷酸之间的相互作用的上下文中使用时“缔合”意指有效载荷经由之间的一个或多个其他分子间接连接至多核糖核苷酸。在一些情况下，附接或缔合可以是瞬时的。在一些情况下，例如，根据环境ph条件或刺激物或结合伴侣的存在或不存在，有效载荷在一种条件下与多核糖核苷酸附接或缔合，而在另一种条件下不与多核糖核苷酸附接或缔合。[0390]术语“药物组合物”旨在同样披露包括在药物组合物中的环状或线性多核糖核苷酸可用于通过疗法治疗人体或动物体。因此，这意味着等同于“在疗法中使用的环状或线性多核糖核苷酸”。[0391]如本文所用，术语“多核苷酸”意指包含一个或多个核酸亚基或核苷酸的分子，并且可以与“核酸”或“寡核苷酸”互换使用。多核苷酸可以包括一个或多个选自腺苷(a)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)或其变体的核苷酸。核苷酸可以包括核苷和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个磷酸(po3)基团。核苷酸可以包括核碱基、五碳糖(核糖或脱氧核糖)以及一个或多个磷酸基团。核糖核苷酸是其中糖为核糖的核苷酸。多核糖核苷酸或核糖核酸或rna可以指包括经由磷酸二酯键聚合的多个核糖核苷酸的大分子。脱氧核糖核苷酸是其中糖是脱氧核糖的核苷酸。[0392]聚脱氧核糖核苷酸或脱氧核糖核酸或dna意指包括经由磷酸二酯键聚合的多个脱氧核糖核苷酸的大分子。核苷酸可以是核苷一磷酸或核苷多磷酸。核苷酸意指包括可检测标签(诸如发光标签)或标志物(例如，荧光团)的脱氧核糖核苷多磷酸，例如脱氧核糖核苷三磷酸(dntp)，其可以选自脱氧腺苷三磷酸(datp)、脱氧胞苷三磷酸(dctp)、脱氧鸟苷三磷酸(dgtp)、尿苷三磷酸(dutp)和脱氧胸苷三磷酸(dttp)dntp。核苷酸可以包括可以掺入正在生长的核酸链中的任何亚基。此类亚基可以是a、c、g、t或u，或对一个或多个互补a、c、g、t或u有特异性或与嘌呤(即，a或g或其变体)或嘧啶(即c、t或u或其变体)互补的任何其他亚基。在一些实例中，多核苷酸是脱氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)或其衍生物或变体。在一些情况下，多核苷酸举几例来说是短干扰rna(sirna)、微小rna(mirna)、质粒dna(pdna)、短发夹rna(shrna)、小核rna(snrna)、信使rna(mrna)、前体mrna(前mrna)、反义rna(asrna)，并且涵盖核苷酸序列及其任何结构实施例，诸如单链、双链、三链、螺旋、发夹等。在一些情况下，多核苷酸分子为环状的。多核苷酸可以具有各种长度。核酸分子可以具有至少约10个碱基、20个碱基、30个碱基、40个碱基、50个碱基、100个碱基、200个碱基、300个碱基、400个碱基、500个碱基、1千碱基(kb)、2kb、3kb、4kb、5kb、10kb、50kb或更大的长度。可以从细胞或组织中分离多核苷酸。如本文所体现的，多核苷酸序列可以包括分离和纯化的dna/rna分子、合成的dna/rna分子和合成的dna/rna类似物。[0393]多核苷酸，例如多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，可以包括一种或多种核苷酸变体，包括非标准核苷酸、非天然核苷酸、核苷酸类似物和/或经修饰的核苷酸。经修饰的核苷酸的实例包括但不限于二氨基嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-d-半乳糖基辨苷(galactosylqueosine)、肌苷、n6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、n6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-d-甘露糖基辫苷(mannosylqueosine)、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-d46-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、怀丁苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-n-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w、2,6-二氨基嘌呤等。在一些情况下，核苷酸在其磷酸酯部分中可以包括修饰，包括对三磷酸酯部分的修饰。此类修饰的非限制性实例包括长度更长的磷酸酯链(例如，具有4、5、6、7、8、9、10个或更多个磷酸酯部分的磷酸酯链)和带有硫醇部分(例如，α-硫代三磷酸酯和β-硫代三磷酸酯)的修饰。核酸分子还可在碱基部分处(例如，在通常可用于与互补核苷酸形成氢键的一个或多个原子处和/或在通常不能与互补核苷酸形成氢键的一个或多个原子处)、糖部分或磷酸骨架处被修饰。核酸分子还可含有胺修饰的基团，诸如氨基烯丙基1-dutp(aa-dutp)和氨基己基丙烯酰胺-dctp(aha-dctp)，以允许胺反应性部分(诸如n-羟基琥珀酰亚胺酯(nhs))的共价附接。本披露的寡核苷酸中标准dna碱基对或rna碱基对的替代物可以提供更高的密度(以位/立方毫米计)、更高的安全性(抗天然毒素的偶然或有目的合成)、更容易辨别光程序性聚合酶(photo-programmedpolymerases)或较低的二级结构。在betzk,malyshevda,lavergnet,weltew,diederichsk,dwyertj,ordoukhanianp,romesbergfe,marxa.nat.chem.biol.[自然-化学生物学]2012年7月；8(7):612-4中描述了与用于从头和/或扩增合成的天然和突变体聚合酶相容的此类替代性碱基对，该文献出于所有目的通过援引并入本文中。[0394]如本文所用，“多肽”意指最常通过肽键连接在一起的氨基酸残基(天然或非天然的)的聚合物。如本文所用，该术语是指任何大小、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。多肽可以包括基因产物、天然存在的多肽、合成多肽、同系物、直系同源物、旁系同源物、前述物质的片段和其他等同物、变体和类似物。多肽可以是单分子或者可以是多分子复合物，诸如二聚体、三聚体或四聚体。它们还可以包含单链或多链多肽，诸如抗体或胰岛素，并且可以缔合或连接。最常见的二硫键存在于多链多肽中。术语多肽也可以适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物。[0395]如本文所用，术语“预防”意指降低发展疾病、病症或病状的可能性，或替代性地降低随后发展的疾病或病症的严重程度。可以将治疗剂施用给相对于一般群体而言发展疾病或病症的风险增加的受试者，以便预防疾病或病状的发展或减轻疾病或病状的严重程度。可以例如在疾病或病症的任何症状或表现发展之前将治疗剂作为预防剂施用。[0396]如本文所用，短语“准螺旋结构”是环状多核糖核苷酸的高阶结构，其中环状多核糖核苷酸的至少一部分折叠成螺旋结构。[0397]如本文所用，短语“准双链二级结构”是环状多核糖核苷酸的高阶结构，其中环状多核糖核苷酸的至少一部分产生内部双链。[0398]如本文所用，术语“调控元件”是修饰环状或线性多核糖核苷酸内表达序列的表达的部分，诸如核酸序列。[0399]如本文所用，术语“重复核苷酸序列”是一段dna或rna内或整个基因组内的重复核酸序列。在一些实施例中，重复核苷酸序列包括聚ca序列或聚tg(ug)序列。在一些实施例中，重复核苷酸序列包括内含子alu家族中的重复序列。[0400]如本文所用，术语“复制元件”是可用于复制或起始环状多核糖核苷酸转录的序列和/或基序。[0401]如本文所用，术语受试者身体的“表面区域”意指受试者的暴露于或可能暴露于受试者身体外部环境的任何区域。受试者身体例如哺乳动物身体(例如人体)的表面区域可以包括皮肤，口腔、鼻腔、耳腔、胃肠道、呼吸道、阴道、宫颈、子宫内、泌尿道和眼睛的表面区域。在一些情况下，受试者身体的表面区域常常可以指上皮细胞排列在其下的外部区域。例如，皮肤可以是本文所讨论的一种类型的表面区域，并且可以由表皮和真皮组成，前者形成皮肤的最外层并且可以包括上皮细胞在许多其他类型的细胞中的有组织的组装。[0402]如本文所用，术语“交错元件”是在翻译期间诱导核糖体暂停的部分，诸如核苷酸序列。在一些实施例中，交错元件是具有强α-螺旋倾向的氨基酸的非保守序列，然后是共有序列-d(v/i)exnpgp，其中x＝任何氨基酸。在一些实施例中，交错元件可以包括化学部分，如甘油、非核酸连接部分、化学修饰、经修饰的核酸或其任何组合。[0403]如本文所用，术语“基本上不含”是组合物、制剂或产物或其任何中间体中某一组分的水平低于诱导生物学、化学、物理和/或药理学作用所需的水平。在一些实施例中，如果某一组分的水平可检测到痕量或该水平低于通过相关检测技术(例如色谱法(使用柱、使用纸、使用凝胶、使用hplc、使用uhplc等，或通过ic、通过sec、通过反相、通过阴离子交换、通过混合模式等)或电泳(ureapage、基于芯片、聚丙烯酰胺凝胶、rna、毛细管、c-ief等)，用或不用分离前或分离后衍生化方法，使用基于质谱、紫外可见、荧光、光散射、折射率的检测技术或使用银或染料染色或放射性衰变以进行检测的检测技术可检测到的水平，则组合物、制剂或产物基本上不含该组分。替代性地，可以在不使用分离技术的情况下通过质谱法、通过显微镜检查、通过圆二色(cd)光谱法、通过uv或uv-可见分光光度法、通过荧光测定法(例如qubit)、通过rna酶h分析、通过表面等离振子共振(spr)或通过利用银或染料染色或放射性衰变进行检测的方法)来确定组合物、制剂或产品是否基本不含某一组分。[0404]如本文所用，术语“基本上对……有抗性”可以指相较于参考物对效应物具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％抗性的物质。[0405]如本文所用，术语“灭菌剂”意指具有抑菌、杀菌和/或主动杀灭微生物，使微生物失活或防止微生物生长的任何试剂。杀灭微生物的灭菌剂可以是抗微生物的和/或抗菌的。在一些实施例中，灭菌剂是液体，诸如醇、碘或过氧化氢。在一些实施例中，灭菌剂是uv光或激光。在一些实施例中，灭菌剂通过电学方式或通过其他方式(例如，蒸气、接触)传递热量。[0406]如本文所用，术语“化学计量翻译”是从环状或线性多核糖核苷酸翻译获得的表达产物的基本上相等的产生。例如，对于具有两个表达序列的环状或线性多核糖核苷酸，环状或线性多核糖核苷酸的化学计量翻译意指两个表达序列的表达产物可具有基本相等的量，例如两个表达序列之间的量差(例如摩尔差)可以为约0，或小于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％或20％或之间的任何百分比。[0407]如本文所用，术语“全身递送”或“全身施用”意指将药物组合物或其他物质施用到循环系统(例如血液或淋巴系统)中的途径。全身施用可以包括口服施用、肠胃外施用、鼻内施用、舌下施用、直肠施用、透皮施用或其任何组合。如本文所用，术语“非全身性递送”或“非全身性施用”可以指除药物组合物或其他物质的全身性递送以外的任何其他施用途径，例如，所递送的物质不进入受试者身体的循环系统(例如，血液和淋巴系统)。[0408]如本文所用，术语“序列同一性”是通过使用全局或局部比对算法对两个肽或两个核苷酸序列进行比对来确定的。当序列(例如，通过程序gap或bestfit使用默认参数进行最佳比对时)至少具有某个最小百分比的序列同一性时，则可以将它们称为“基本上相同”或“基本相似”。gap使用needleman和wunsch全局比对算法在两个序列的整个长度上对其进行比对，从而最大程度地增加了匹配数目并最大程度地减少了空位数目。通常，使用gap默认参数，空位产生罚分＝50(核苷酸)/8(蛋白质)，空位延伸罚分＝3(核苷酸)/2(蛋白质)。对于核苷酸，使用的默认评分矩阵是nwsgapdna而对于蛋白质，使用的默认评分矩阵是blosum62(henikoff和henikoff,1992,pnas[美国国家科学院院刊]89,915-919)。序列比对和百分比序列同一性的评分可以使用计算机程序来确定，诸如可从美国92121-3752加州圣地亚哥斯克兰顿路9685号的阿赛乐德公司(accelrysinc.,9685scrantonroad,sandiego,ca)获得的gcgwisconsin软件包10.3版或embosswin2.10.0版(使用程序“needle”)确定。替代性地或另外，可以通过使用诸如fasta、blast等的算法对数据库进行搜索来确定同一性百分比。序列同一性是指在序列的整个长度上的序列同一性。[0409]“信号序列”是指长度例如介于10至30个氨基酸之间的多肽序列，其存在于新生蛋白的多肽序列的n端，将多肽序列靶向分泌途径。[0410]如本文所用，术语“靶标”是指包括一个或多个表位的任何实体。例如，靶标可以是化学部分、分子的一部分、分子(例如，过敏原或毒素)、大分子(例如，多肽、核酸或碳水化合物)、大分子的翻译后修饰状态(例如，磷酸化、糖基化、酰化、烷基化等的大分子)、高阶大分子结构(例如，两个或更多个多肽的复合物)、细胞(例如，癌细胞)、细胞的一部分(例如，肿瘤抗原)、细胞表面上的受体、病原体(例如，病毒或病毒的一部分；细菌或细菌的一部分；真菌或真菌的一部分；或寄生虫或寄生虫的一部分)或组织类型。[0411]如本文所用，术语“治疗”是指对受试者的疾病或病症(例如，感染性疾病、癌症、中毒或过敏反应)的治疗性治疗。治疗的效果可以包括与没有治疗性治疗的情况下，该疾病或病症的状态和/或状况相比，逆转、减轻、降低疾病的严重程度，治愈疾病，抑制疾病的进展，降低该疾病、或疾病或病症的一种或多种症状或表现的复发的可能性，稳定(即不恶化)疾病或病症的状态，和/或预防疾病或病症的传播。[0412]如本文所用，术语“终止元件”是终止环状或线性多核糖核苷酸中表达序列的翻译的部分，诸如核酸序列。[0413]如本文所用，术语“局部递送”意指将物质递送至皮肤或可通过非侵入性方式接近的上皮层，例如肠和其他胃肠(gi)上皮或阴道上皮。药物组合物的局部递送可以对受试者具有局部药效学作用，例如，局部递送的药物组合物在递送药物组合物的身体特定部位(例如皮肤)处或其附近具有药效学作用。在一些其他实施例中，如本文所讨论的药物组合物的局部递送仅用于指递送模式(局部递送至例如特定表面区域)，而药物组合物可以具有局部或全身药效学作用。例如，药物组合物可以停留在施用部位的局部或附近，或者可以进入受试者身体的循环系统(例如，血液或淋巴系统)，通过该循环系统，药物组合物可以被运输至身体的远端部分，这些远端部分通常是药物组合物经由循环系统以外的途径不能到达的。[0414]如本文所用，术语“总核糖核苷酸分子”意指通过核糖核苷酸分子的总质量所测量的任何核糖核苷酸分子的总量，包括线性多核糖核苷酸分子、环状多核糖核苷酸分子、单体核糖核苷酸、其他多核糖核苷酸分子、其片段及其经修饰的变体。[0415]如本文所用，术语“翻译效率”是从核糖核苷酸转录物产生蛋白质或肽的速率或量。在一些实施例中，翻译效率可以表示为给定量的编码蛋白质或肽的转录本产生的蛋白质或肽的量，例如在给定的时间段内，例如在给定的翻译系统中，例如体外翻译系统(像兔网织红细胞裂解物)或体内翻译系统(像真核细胞或原核细胞)。[0416]如本文所用，术语“翻译起始序列”是在环状或线性多核糖核苷酸中起始表达序列的翻译的核酸序列。附图说明[0417]图1a-1b是包括两个表达序列的示例性环状rna的示意图，其中每个表达序列编码免疫原或佐剂。图1a描绘包括两个开放阅读框(orf)的环状多核糖核苷酸，每个orf编码表达序列，其中每个orf与ires可操作地连接。图1b描绘包括两个被2a序列隔开的表达序列的环状多核糖核苷酸，所有表达序列均与ires可操作地连接。[0418]图2示出了包括编码免疫原和多核苷酸佐剂序列(例如，刺激先天性免疫系统的核苷酸序列)的orf的环状rna的示意图。[0419]图3示出了多个多核糖核苷酸的示意图，其中每个多核苷酸包括编码免疫原或佐剂的orf。[0420]图4示出了由环状rna编码的rbd免疫原在bj成纤维细胞和hela细胞中检测到，而在用媒介物对照的bj成纤维细胞和hela细胞未检测到。[0421]图5示出了在小鼠模型中，施用经阳离子聚合物(例如，鱼精蛋白)配制的编码sars-cov-2rbd免疫原的环状rna后，获得可持续的抗rbd抗体反应。[0422]图6示出了在小鼠模型中，施用经阳离子聚合物(例如，鱼精蛋白)配制的编码sars-cov-2rbd抗原的环状rna后，获得抗刺突反应。[0423]图7示出了在小鼠模型中，施用经阳离子聚合物(例如，鱼精蛋白)配制的编码sars-cov-2rbd免疫原的环状rna后获得的抗-rbdigg2a和igg1同种型水平。[0424]图8示出了在肌内注射环状rna制剂(trans-it配制的、鱼精蛋白配制的、未配制的)、仅鱼精蛋白媒介物后和在未注射的对照小鼠中，长期从体内环状rna表达蛋白质。[0425]图9示出了在同时肌内递送addavaxtm佐剂与(i)未配制的环状rna制剂(左图)，(ii)经transit配制的环状rna(中间图)，和(iii)经鱼精蛋白配制的环状rna(右图)后，长期从体内环状rna表达蛋白质。在每种情况下，addavaxtm佐剂均在0和24小时以单独注射的形式递送。[0426]图10示出了在皮内递送(i)经鱼精蛋白配制的环状rna、(ii)经鱼精蛋白配制的环状rna(在24小时注射addavaxtm佐剂)、(iii)仅鱼精蛋白媒介物后，以及(iv)在未注射的对照小鼠中，长期从体内环状rna表达蛋白质。[0427]图11示出了探针与环状和线性rna的结合以及rna酶h对rna的后续降解。环状rna作为单一裂解的线性条带被检测到，相比而言环状和连环化rna作为多个条带被检测到。通过使样品在变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳并比较添加或不添加rna酶h的降解条带来检测降解。[0428]图12示出了通过将线性rna条带强度与线性rna标准品进行比较而在变性聚丙烯酰胺凝胶上定量的线性rna含量。[0429]图13示出了从变性聚丙烯酰胺凝胶的不同条带中提取的rna的定量。[0430]图14示出了在使用84％纯度的环状rna、71％纯度的环状rna、和仅媒介物的实验中转染后6、24、48、72、96和120小时的细胞中的高斯荧光素酶活性。[0431]图15示出了与用组合的环状rna和线性对应物rna两者转染的细胞(以剂量依赖性方式展现出对这些先天性免疫基因的上调)相比，用仅凝胶纯化的环状rna制剂转染的细胞显示出先天性免疫基因诸如rig-i、mda-5、oas和ifn-b的最低表达。[0432]图16是示出了具有交错元件的环状rna或线性rna的表达产物的蛋白质印迹的图像。[0433]图17示出了通过自剪接对示例性环状rna的生成。[0434]图18说明了一个实例，其中将示例性的线性和环状rna局部递送至小鼠的耳朵皮肤，并在递送期后6小时至3天检查它们在耳朵组织中的rna水平。[0435]图19a和图19b是总结了在增进剂(boost)(乙醇)的帮助下局部递送线性或环状rna后6小时、1天、3天或12天得自小鼠耳朵打孔样品的qpcr结果的图。图19a示出了使用用于检测线性和环状rna的引物进行的qpcr测定的结果。图19b示出了使用用于检测环状rna而不是线性rna的引物进行的qpcr测定的结果。[0436]图20示出了局部施用circrna-cy5导致将rna递送至组织的荧光图像(b/w)。[0437]图21示出了局部施用circrna-cy5导致将rna递送至组织的荧光图像的定量。[0438]图22示出了当在施加前用乙醇擦拭物擦拭组织时，局部施用环状rna导致在施用后第1天和第4天将rna递送至组织。[0439]图23示出了当在施加前用异丙醇擦拭物擦拭组织时，局部施用环状rna导致在施用后第1天和第4天将rna递送至组织。[0440]图24示出了当circrna与10％乙醇一起施用时，局部施用circrna导致将rna递送至组织。[0441]图25是示出了环状rna或线性rna的表达产物的蛋白质印迹的图像。[0442]图26示出了实验数据，证明与线性多核糖核苷酸对应物(“线性”)相比，用环状多核糖核苷酸(“无末端的”)再给药后小鼠中的高斯荧光素酶表达的持久性增加。[0443]图27示出了实验数据，证明与交错给药线性多核糖核苷酸对应物(“线性3剂”)，或单剂的环状多核糖核苷酸(“无末端的”)，或单剂的线性多核糖核苷酸对应物(“线性”)相比，交错给药环状多核糖核苷酸(“无末端的3剂”)后小鼠中的高斯荧光素酶表达的持久性增加。[0444]图28示出了实验数据，证明与单剂的线性多核糖核苷酸对应物(“线性rna”)相比，cov-2rbd免疫原的环状rna，或(ii)编码gluc多肽的第一环状rna和编码sars-cov-2rbd免疫原的第二环状rna的组合，或(iii)编码gluc多肽和sars-cov-2rbd免疫原两者的环状rna。[0458]图37b示出了施用了以下物质的小鼠中，通过噬斑减少中和试验(prnt)评价的抗rbd中和抗体：(i)编码sars-cov-2rbd免疫原的环状rna，或(ii)编码gluc多肽的第一环状rna和编码sars-cov-2rbd免疫原的第二环状rna的组合，或(iii)编码gluc多肽和sars-cov-2rbd免疫原两者的环状rna。[0459]图38示出了正如通过elispot测定法确定的，编码gluc多肽和sars-cov-2rbd免疫原的环状rna引发rbd特异性t细胞反应。[0460]图39示出了使用il-12特异性elisa测量的il-12由哺乳动物细胞中的环状rna表达。包括编码sars-cov-2rbd免疫原的环状rna作为阴性对照。[0461]图40a示出了在小鼠模型中，在注射包括编码il-12的第一环状rna和编码sars-cov-2rbd免疫原的第二环状rna的环状rna制剂后2天，在血清中检测到il-12表达。包括注射pbs或仅包括编码sars-cov-2rbd免疫原的环状rna的制剂作为对照。[0462]图40b示出了在小鼠模型中，在注射包括编码il-12的第一环状rna和编码sars-cov-2rbd免疫原的第二环状rna的环状rna制剂后2天，在血清中检测到血清ifn-γ增加(直接在il12信号传导的下游)。包括注射pbs或仅包括编码sars-cov-2rbd免疫原的环状rna的制剂作为对照。[0463]图41a示出了施用包括编码il-12的第一环状rna和编码sars-cov-2rbd免疫原的第二环状rna的环状rna制剂使sars-cov-2rbd特异性cd4t细胞的数目增加。包括施用pbs或仅包括编码sars-cov-2rbd免疫原的环状rna的制剂作为对照。星号表示通过双因素rmanova保护的tukey事后检验测定的统计学显著性。[0464]图41b示出了施用包括编码il-12的第一环状rna和编码sars-cov-2rbd免疫原的第二环状rna的环状rna制剂在rbd特异性cd8t细胞的数目方面未产生变化。包括施用pbs或仅包括编码sars-cov-2rbd免疫原的环状rna的制剂作为对照。[0465]图41c示出了施用包括编码il-12的第一环状rna和编码sars-cov-2rbd免疫原的第二环状rna的环状rna制剂使cd4t细胞的ifn-γ产量增加。包括施用pbs或仅包括编码sars-cov-2rbd免疫原的环状rna的制剂作为对照。星号表示通过非配对t检验测定的统计学显著性。[0466]图41d示出了施用包括编码il-12的第一环状rna和编码sars-cov-2rbd免疫原的第二环状rna的环状rna制剂使cd8t细胞的ifn-γ产量增加。包括施用pbs或仅包括编码sars-cov-2rbd免疫原的环状rna的制剂作为对照。星号表示通过非配对t检验测定的统计学显著性。[0467]图42示出了当与对照(仅表达ova的环状rna)相比时，表达卵白蛋白(ova)的环状rna与表达il12的环状rna组合诱导更强的cd8t细胞反应。这证明表达il12的环状rna充当佐剂。具体实施方式[0468]本披露提供了编码一种或多种多肽免疫原的环状或线性多核糖核苷酸的组合物和药物制剂及其用途。特别地，本披露提供了编码多种免疫原的环状或线性多核糖核苷酸，编码至少一种免疫原并进一步编码至少一种佐剂的环状或线性多核糖核苷酸，以及包含多种环状或线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物。本披露的特征还在于包括一种或多种编码一种或多种免疫原的环状或线性多核糖核苷酸的药物组合物和制剂。本文所述的环状或线性多核糖核苷酸的组合物和药物制剂在施用后可在受试者中诱导免疫反应。本文所述的环状或线性多核糖核苷酸的组合物和药物制剂可用于治疗或预防受试者的疾病、病症或病状。[0469]多核糖核苷酸[0470]多核糖核苷酸除了包括如本文所述的一种或多种免疫原外，也包括如下所述的元件。在特定的实施例中，多核糖核苷酸是环状多核糖核苷酸。[0471]在一些实施例中，多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸)为至少约20个核苷酸、至少约30个核苷酸、至少约40个核苷酸、至少约50个核苷酸、至少约75个核苷酸、至少约100个核苷酸、至少约200个核苷酸、至少约300个核苷酸、至少约400个核苷酸、至少约500个核苷酸、至少约1,000个核苷酸、至少约2,000个核苷酸、至少约5,000个核苷酸、至少约6,000个核苷酸、至少约7,000个核苷酸、至少约8,000个核苷酸、至少约9,000个核苷酸、至少约10,000个核苷酸、至少约12,000个核苷酸、至少约14,000个核苷酸、至少约15,000个核苷酸、至少约16,000个核苷酸、至少约17,000个核苷酸、至少约18,000个核苷酸、至少约19,000个核苷酸或至少约20,000个核苷酸。[0472]在一些实施例中，多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸)可以具有足够的大小以容纳核糖体的结合位点。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的最大大小可以与产生环状多核糖核苷酸和/或使用环状多核糖核苷酸的技术限制内的一样大。不受任何特定理论的束缚，有可能rna的多个区段可以从dna产生并且其5'游离末端和3'游离末端退火以产生一“串”rna，当只留有一个5'游离末端和一个3'游离末端时，该“串”rna最终可能会被环化。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的最大尺寸可能受包装rna并将其递送至靶标的能力所限制。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的大小是足以编码有用的多肽(诸如本披露的免疫原或其表位)的长度，并且因此至少20,000个核苷酸、至少15,000个核苷酸、至少10,000个核苷酸、至少7,500个核苷酸或至少5,000个核苷酸、至少4,000个核苷酸、至少3,000个核苷酸、至少2,000个核苷酸、至少1,000个核苷酸、至少500个核苷酸、至少400个核苷酸、至少300个核苷酸、至少200个核苷酸、至少100个核苷酸、或至少70个核苷酸的长度可能是有用的。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的最大大小是足以编码一种或多种免疫原(例如，两种或更多种，三种或更多种，四重或更多种，以及五种或更多种)的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的最大大小是足以编码两种至五种(例如三种、四种和五种)免疫原的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的最大大小是足以编码免疫原和佐剂的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的最大大小是足以编码一种或多种免疫原(例如，两种或更多种，三种或更多种，以及四种或更多种)和一种或多种佐剂(例如，两种或更多种，三种或更多种，以及四种或更多种)的长度。[0473]环状多核糖核苷酸元件[0474]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸除了包括编码免疫原的序列之外，还包括如本文所述的一种或多种元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺乏聚a序列，缺乏游离的3'末端，缺乏rna聚合酶识别基序，或它们的任何组合。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括如通过援引以其全文并入本文的国际专利公开号wo2019/118919中披露的任何特征或特征的任何组合。[0475]免疫原[0476]本文所述的环状或线性多核糖核苷酸包含至少一个编码免疫原的序列，并且任选地进一步包含至少一个编码佐剂的序列。免疫原包括被给定抗体或t细胞受体识别、靶向或结合的一个或多个表位。表位可以是线性表位，例如核酸或氨基酸的连续序列。表位可以是构象表位，例如，含有在蛋白质的折叠构象中形成表位的氨基酸的表位。构象表位可以含有来自一级氨基酸序列的非连续氨基酸。再如，构象表位包括基于其二级结构或三级结构在免疫原性序列的折叠构象中形成表位的核酸。[0477]在一些实施例中，免疫原包括蛋白质、肽、糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白、核糖核蛋白、碳水化合物(例如，多糖)、脂质(例如，磷脂或甘油三酸酯)或核酸(例如，dna、rna)的全部或一部分。[0478]在其他实施例中，免疫原包括蛋白质免疫原或表位(例如，来自蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白或核糖核蛋白的肽免疫原或肽表位)。免疫原可以包括氨基酸、糖、脂质、磷酰基或磺酰基或其组合。[0479]在特定实施例中，免疫原是多肽免疫原。[0480]多肽免疫原可以包括翻译后修饰，例如糖基化、泛素化、磷酸化、亚硝基化、甲基化、乙酰化、酰胺化、羟基化、硫酸化或脂化。[0481]在一些实施例中，免疫原包括表位，该表位包括至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个或至少30个氨基酸，或更多个氨基酸。在一些实施例中，表位包括或含有至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、至多10个、至多11个、至多12个、至多13个、至多14个、至多15个、至多16个、至多17个、至多18个、至多19个、至多20个、至多21个、至多22个、至多23个、至多24个、至多25个、至多26个、至多27个、至多28个、至多29个或至多30个氨基酸，或更少的氨基酸。在一些实施例中，表位包括或含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸。在一些实施例中，表位含有5个氨基酸。在一些实施例中，表位含有6个氨基酸。在一些实施例中，表位含有7个氨基酸。在一些实施例中，表位含有8个氨基酸。在一些实施例中，表位可以是约8至约11个氨基酸。在一些实施例中，表位可以是约9至约22个氨基酸。[0482]免疫原可以包括被b细胞识别的免疫原、被t细胞识别的免疫原或其组合。在一些实施例中，免疫原包括被b细胞识别的免疫原。在一些实施例中，免疫原是被b细胞识别的免疫原。在一些实施例中，免疫原包括被t细胞识别的免疫原。在一些实施例中，免疫原是被t细胞识别的免疫原。[0483]表位可以包括被b细胞识别的表位，被t细胞识别的表位或其组合。在一些实施例中，表位包括被b细胞识别的表位。在一些实施例中，表位是被b细胞识别的表位。在一些实施例中，表位包括被t细胞识别的表位。在一些实施例中，表位是被t细胞识别的表位。[0484]例如，用于经由电脑模拟鉴定免疫原和表位的技术例如在sanchez-trincadojl等人(fundamentalsandmethodsfort-andb-cellepitopeprediction[t细胞和b细胞表位预测的基本原理和方法],j.immunol.res.[免疫学研究杂志],2017:2680160.doi:10.1155/2017/2680160(2017))；grifoni,a等人(asequencehomologyandbioinformaticapproachcanpredictcandidatetargetsforimmuneresponsestosars-cov-2[序列同源性和生物信息学方法可以预测sars-cov-2免疫反应的候选靶点],cellhostmicrobe[细胞宿主与微生物],27(4):671-680(2020))；russirc等人(insilicopredictionofepitopesrecognizedbytcellsandbcellsinpmpd:firststeptowardstothedesignofachlamydiatrachomatisvaccine[pmpd中t细胞和b细胞识别的表位的电脑模拟预测：设计沙眼衣原体疫苗的第一步],biomedicalj.[生物医学杂志]41(2):109-117(2018))；baruahv等人(immunoinformatics-aidedidentificationoftcellandbcellepitopesinthesurfaceglycoproteinof2019-ncov[免疫信息学辅助鉴定2019-ncov表面糖蛋白中的t细胞和b细胞表位],j.med.virol.[医学病毒学杂志],92(5),doi:10.1002/jmv.25698(2020))中已经披露；其每一者均通过援引以其全文并入本文。[0485]在一些实施例中，免疫原包括多核苷酸。在一些实施例中，免疫原是多核苷酸。在一些实施例中，免疫原包括rna。在一些实施例中，免疫原是rna。在一些实施例中，免疫原包括dna。在一些实施例中，免疫原是dna。在一些实施例中，多核苷酸在环状或线性多核糖核苷酸中编码。[0486]本披露的环状或线性多核糖核苷酸包括或编码任何数量的免疫原。在特定实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括或编码至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少40种、至少50种、至少60种、至少70种、至少80种、至少90种、至少100种、至少120种、至少140种、至少160种、至少180种、至少200种、至少250种、至少300种、至少350种、至少400种、至少450种、至少500种或更多种免疫原。[0487]在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括或编码例如至多1种、至多2种、至多3种、至多4种、至多5种、至多6种、至多7种、至多8种、至多9种、至多10种、至多15种、至多20种、至多25种、至多30种、至多40种、至多50种、至多60种、至多70种、至多80种、至多90种、至多100种、至多120种、至多140种、至多160种、至多180种、至多200种、至多250种、至多300种、至多350种、至多400种、至多450种、至多500种或更少的免疫原。[0488]在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括或编码约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450或500种免疫原。[0489]在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸编码多种免疫原。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括或编码1至100种免疫原。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括或编码1至50种免疫原。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括或编码1至10种免疫原；例如，环状或线性多核糖核苷酸编码1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种免疫原。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括或编码2种免疫原。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括或编码3种免疫原。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括或编码4种免疫原。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括或编码5种免疫原。[0490]在一些实施例中，该多种免疫原各自鉴别相同的靶标。换个说法，单个靶标可以包括该多种免疫原中的每一种，该多种免疫原中的每一种都可以源自同一靶标，和/或该多种免疫原中的每一种可以与一部分或整个靶标具有高度相似性。例如，靶标可以是细胞，并且每种免疫原可以对应于该细胞的蛋白质。例如，靶标可以是特定的癌细胞，并且每种免疫原可以对应于与该癌症相关的肿瘤抗原。因此，在一些实施例中，该多种免疫原中的每一种均源自来自相同靶标的不同蛋白质。[0491]在一些实施例中，该多种免疫原源自不同靶标。在一些实施例中，该多种免疫原可以源自给定病毒的各种衣壳蛋白。例如，一种免疫原可以源自正痘病毒(orthopoxvirus)，另一种免疫原可以源自嗜肝dna病毒(hepadnavirus)，而第三免疫原可以源自黄病毒(flavivirus)。例如，多核糖核苷酸可编码多种免疫原，其中每种免疫原源自黄热病病毒、基孔肯雅病毒、寨卡病毒(zika)、甲型肝炎或乙型肝炎。多核糖核苷酸可编码来自黄热病病毒、基孔肯雅病毒、寨卡病毒、甲型肝炎和乙型肝炎中的每一种的免疫原。多核糖核苷酸可编码多种免疫原，其中每种免疫原源自日本脑炎(japaneseencephalitis)、基孔肯雅病毒、寨卡病毒、甲型肝炎或乙型肝炎。多核糖核苷酸可编码来自日本脑炎、基孔肯雅病毒、寨卡病毒、甲型肝炎或乙型肝炎的每一种的免疫原。多核糖核苷酸可编码多种免疫原，其中每种免疫原源自sars-cov2、痘病毒、呼吸道合胞病毒或人乳头瘤病毒。多核糖核苷酸可编码来自sars-cov2、痘病毒、呼吸道合胞病毒和人乳头瘤病毒中的每一种的免疫原。多核糖核苷酸可编码多种免疫原，其中每种免疫原源自疱疹病毒(cmv、ebv或vzv)。多核糖核苷酸可编码来自以下每种疱疹病毒的免疫原：cmv、ebv或vzv。多核糖核苷酸可编码多种免疫原，其中每种免疫原源自带状疱疹病毒(singles)或西尼罗河病毒(westnilevirus)。多核糖核苷酸可编码来自带状疱疹病毒和西尼罗河病毒中的每一种的免疫原。[0492]在一些实施例中，该多种免疫原具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些实施例中，该多种免疫原也具有小于100％的序列同一性。这可能指示由于遗传漂变而彼此相关的免疫原，因此，单个环状或线性多核糖核苷酸组合物或免疫原性组合物可能能够诱导针对群体中以各种突变状态存在的靶标的免疫反应，或者可能诱导针对具有相同免疫原的多个靶标的免疫反应，其中该免疫原与遗传漂变相关。例如，免疫原可以通过靶病毒的遗传漂移而彼此相关。在一些实施例中，该多种免疫原可以源自来自独特但相关的病毒的受体结合结构域(rbd)。[0493]在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸编码免疫原的变体。变体可以是天然存在的变体(例如，在来自不同的病毒属、种、分离株或准种的序列数据中鉴定的变体)，或者可以是如本文所披露的已经经由电脑模拟生成的衍生序列(例如，与野生型抗原或表位相比具有一个或多个氨基酸插入、缺失、取代或其组合的免疫原或表位)。[0494]免疫原来自例如病毒，诸如病毒表面蛋白、病毒膜蛋白、病毒包膜蛋白、病毒衣壳蛋白、病毒核衣壳蛋白、病毒刺突蛋白、病毒进入蛋白、病毒膜融合蛋白、病毒结构蛋白、病毒非结构蛋白、病毒调控蛋白、病毒辅助蛋白、分泌型病毒蛋白、病毒聚合酶蛋白、病毒dna聚合酶、病毒rna聚合酶、病毒蛋白酶、病毒糖蛋白、病毒融合蛋白、病毒螺旋衣壳蛋白、病毒二十面体衣壳蛋白、病毒基质蛋白、病毒复制酶、病毒转录因子或病毒酶。[0495]在一些实施例中，免疫原来自这些病毒之一：[0496]正粘病毒(orthomyxovirus)：有用的免疫原可以来自甲型、乙型或丙型流感病毒，诸如血凝素、神经氨酸酶或基质m2蛋白。在免疫原是甲型流感病毒血凝素的情况下，它可以来自任何亚型，例如hi、h2、h3、h4、h5、h6、h7、h8、h9、h10、h11、h12、h13、h14、h15或h16。[0497]副粘病毒科(paramyxoviridae)病毒：病毒免疫原包括但不限于源自肺炎病毒(pneumovirus)(例如呼吸道合胞病毒(rsv))、风疹病毒(rubulavirus)(例如腮腺炎病毒)、副粘病毒(例如副流感病毒)、偏肺病毒(metapneumovirus)和麻疹病毒(morbillivirus)(例如麻疹病毒)、亨尼巴病毒(henipavirus)(例如尼帕病毒(nipahvirus))。[0498]痘病毒科(poxviridae)：病毒免疫原包括但不限于源自正痘病毒的那些，正痘病毒例如天花(variolavera)，包括但不限于大天花(variolamajor)和小天花(variolaminor)。[0499]微小核糖核酸病毒(picornavirus)：病毒免疫原包括但不限于源自微小核糖核酸病毒的那些，微小核糖核酸病毒诸如肠病毒(enterovirus)、鼻病毒(rhinovirus)、嗜肝rna病毒(heparnavirus)、心脏病毒(cardiovirus)和口蹄疫病毒(aphthovirus)。在一个实施例中，肠病毒是脊髓灰质炎病毒，例如1型、2型和/或3型脊髓灰质炎病毒。在另一个实施例中，肠病毒是ev71肠病毒。在另一个实施例中，肠病毒是柯萨奇病毒(coxsackie)a或b。[0500]布尼亚病毒(bunyavirus)：病毒免疫原包括但不限于源自以下的那些：正布尼亚病毒(orthobunyavirus)，诸如加州脑炎病毒(californiaencephalitisvirus)；白蛉病毒(phlebovirus)，诸如裂谷热病毒(riftvalleyfevervirus)；或内罗病毒(nairovirus)，诸如克里米亚-刚果出血热病毒(crimean-congohemorrhagicfevervirus)。[0501]嗜肝rna病毒(heparnavirus)：病毒免疫原包括但不限于源自嗜肝rna病毒，诸如甲型肝炎病毒(hav)的那些。[0502]丝状病毒(filovirus)：病毒免疫原包括但不限于源自丝状病毒的那些，丝状病毒诸如埃博拉病毒(ebolavirus)(包括扎伊尔(zaire)、科特迪瓦(ivorycoast)、雷斯顿(reston)或苏丹(sudan)埃博拉病毒)或马尔堡病毒(marburgvirus)。[0503]披膜病毒(togavirus)：病毒免疫原包括但不限于源自披膜病毒的那些，披膜病毒诸如风疹病毒(rubivirus)、甲病毒(alphavirus)或动脉炎病毒(arterivirus)。这包括风疹病毒(rubellavirus)。[0504]黄病毒(flavivirus)：病毒免疫原包括但不限于源自黄病毒的那些，黄病毒诸如蜱传脑炎(tbe)病毒、登革热(1、2、3或4型)病毒、黄热病毒、日本脑炎病毒、科萨努尔森林病毒(kyasanurforestvirus)、西尼罗河脑炎病毒(westnileencephalitisvirus)、圣路易斯脑炎病毒(st.louisencephalitisvirus)、俄罗斯春夏脑炎病毒(russianspring-summerencephalitisvirus)、波瓦生脑炎病毒(powassanencephalitisvirus)、寨卡病毒。[0505]瘟病毒(pestivirus)：病毒免疫原包括但不限于源自瘟病毒的那些，瘟病毒诸如牛病毒性腹泻病毒(bvdv)、经典猪瘟病毒(csfv)或边界病病毒(bdv)。[0506]嗜肝dna病毒：病毒免疫原包括但不限于源自嗜肝dna病毒，诸如乙型肝炎病毒的那些。乙型肝炎病毒免疫原可以是乙型肝炎病毒表面免疫原(hbsag)。[0507]其他肝炎病毒：病毒免疫原包括但不限于源自丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒或庚型肝炎病毒的那些。[0508]弹状病毒(rhabdovirus)：病毒免疫原包括但不限于源自弹状病毒，诸如狂犬病病毒(lyssavirus){例如狂犬病毒(rabiesvirus))和水疱病毒(vesiculovirus，vsv)的那些。[0509]杯状病毒科(caliciviridae)：病毒免疫原包括但不限于源自杯状病毒科的那些，杯状病毒科诸如诺沃克病毒(norwalkvirus)(诺如病毒(norovirus))和诺沃克样病毒(诸如夏威夷病毒(hawaiivirus)和雪山病毒(snowmountainvirus))。[0510]逆转录病毒(retrovirus)：病毒免疫原包括但不限于源自肿瘤病毒(oncovirus)、慢病毒(lentivirus)(例如hiv-1或hiv-2)或泡沫病毒(spumavirus)的那些。[0511]呼肠孤病毒(reovirus)：病毒免疫原包括但不限于源自正呼肠孤病毒(orthoreovirus)、轮状病毒(rotavirus)、环状病毒(orbivirus)或科蜱病毒(coltivirus)的那些。[0512]细小病毒(parvovirus)：病毒免疫原包括但不限于源自细小病毒b19的那些。[0513]博卡病毒(bocavirus)：病毒免疫原包括但不限于源自博卡病毒的那些。[0514]疱疹病毒(herpesvirus)：病毒免疫原包括但不限于源自人疱疹病毒的那些，仅举例而言，人疱疹病毒诸如单纯疱疹病毒(hsv)(例如hsv1型和2型)、水痘带状疱疹病毒(vzv)、爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv)、巨细胞病毒(cmv)、人疱疹病毒6(hhv6)、人疱疹病毒7(hhv7)和人疱疹病毒8(hhv8)。[0515]乳多空病毒(papovavirus)：病毒免疫原包括但不限于源自乳头瘤病毒(papillomavirus)和多瘤病毒(polyomavirus)的那些。(人)乳头瘤病毒可以是血清型1、2、4、5、6、8、11、13、16、18、31、33、35、39、41、42、47、51、57、58、63或65，例如来自血清型6、11、16和/或18中的一种或多种。[0516]正汉坦病毒(orthohantavirus)：病毒免疫原包括但不限于源自汉坦病毒(hantavirus)的那些。[0517]沙粒病毒(arenavirus)：病毒免疫原包括但不限于源自瓜纳里托病毒(guanaritovirus)、胡宁病毒(juninvirus)、拉萨病毒(lassavirus)、卢约病毒(lujovirus)、马丘波病毒(machupovirus)、萨比亚病毒(sabiavirus)或白水河病毒(whitewaterarroyovirus)的那些。[0518]腺病毒(adenovirus)：病毒免疫原包括源自腺病毒血清型36(ad-36)的那些。[0519]社区获得性呼吸道病毒：病毒免疫原包括源自社区获得性呼吸道病毒的那些。[0520]冠状病毒(coronavirus)：病毒免疫原包括但不限于源自sars冠状病毒(例如，sars-cov-1和sars-cov-2)、mers冠状病毒、禽传染性支气管炎(ibv)、小鼠肝炎病毒(mhv)和猪传染性胃肠炎病毒(tgev)的那些。冠状病毒免疫原可以是刺突多肽或是刺突蛋白的受体结合结构域(rbd)。冠状病毒免疫原也可以是包膜多肽、膜多肽或核衣壳多肽。[0521]在一些实施例中，免疫原来自感染鱼类的病毒。在一些实施例中，免疫原引发针对感染鱼类的病毒的免疫反应。例如，感染鱼类的病毒选自传染性鲑鱼贫血病毒(isav)、鲑鱼胰腺疾病病毒(spdv)、感染性胰腺坏死病毒(ipnv)、斑点叉尾鮰病毒(ccv)、鱼淋巴囊肿病病毒(fldv)、传染性造血组织坏死症病毒(ihnv)、锦鲤疱疹病毒、鲑鱼小核糖核酸样病毒(也称为大西洋鲑小核糖核酸样病毒)、陆封鲑病毒(lsv)、大西洋鲑轮状病毒(asr)、鳟鱼草莓病病毒(tsd)、银鲑肿瘤病毒(cstv)或病毒性出血性败血症病毒(vhsv)。[0522]在一些实施例中，免疫原来自宿主受试者细胞。例如，可以通过使用来自病毒用作进入因子的宿主细胞组分的免疫原或表位来产生阻断病毒进入的抗体。[0523]免疫原来自例如细菌，诸如细菌表面蛋白、细菌膜蛋白、细菌包膜蛋白、细菌内膜蛋白、细菌外膜蛋白、细菌周质蛋白、细菌进入蛋白、细菌膜融合蛋白、细菌结构蛋白、细菌非结构蛋白、分泌型细菌蛋白、细菌聚合酶蛋白、细菌dna聚合酶、细菌rna聚合酶、细菌蛋白酶、细菌糖蛋白、细菌转录因子、细菌酶或细菌毒素。[0524]在一些实施例中，免疫原引发来自这些细菌之一的免疫反应：无乳链球菌(streptococcusagalactiae)(也称为b族链球菌或gbs)；化脓性链球菌(streptococcuspyogenes)(也称为a族链球菌(gas))；金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)；表皮葡萄球菌(staphylococcusepidermis)；梅毒螺旋体(treponemapallidum)；土拉弗朗西斯菌(francisellatularensis)；立克次氏体物种(rickettsiaspecies)；鼠疫耶尔森氏菌(yersiniapestis)；脑膜炎奈瑟球菌(neisseriameningitidis)：免疫原包括但不限于膜蛋白，诸如粘附素、自主转运蛋白、毒素、铁获取蛋白和因子h结合蛋白；肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae)；卡他莫拉菌(moraxellacatarrhalis)；百日咳博德特氏菌(bordetellapertussis)：免疫原包括但不限于百日咳毒素或类毒素(pt)、丝状血凝素(fha)、百日咳杆菌粘附素及凝集原2和3；破伤风梭菌(clostridiumtetani)：典型的免疫原是破伤风类毒素；白喉棒状杆菌(cornynebacteriumdiphtheriae)：典型的免疫原是白喉类毒素；流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenzae)；铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)；沙眼衣原体(chlamydiatrachomatis)；肺炎衣原体(chlamydiapneumoniae)；幽门螺杆菌(helicobacterpylori)；大肠杆菌(escherichiacoli)(免疫原包括但不限于源自产肠毒素的大肠杆菌(etec)、肠聚集性大肠杆菌(eaggec)、弥漫性粘附大肠杆菌(daec)、肠致病性大肠杆菌(epec)、肠外致病性大肠杆菌(expec)和/或肠出血性大肠杆菌(ehec)的免疫原)。expec菌株包括尿道致病性大肠杆菌(upec)和脑膜炎/败血症相关大肠杆菌(mnec)。还包括炭疽杆菌(bacillusanthracis)；产气荚膜梭状芽孢杆菌(clostridiumperfringens)或肉毒梭状芽孢杆菌(clostridiumbotulinums)；嗜肺军团菌(legionellapneumophila)；伯纳特柯克斯体(coxiellaburnetiid)；布鲁氏菌属(brucella)的种，诸如流产布鲁氏菌(b.abortus)、犬布鲁氏菌(b.canis)、羊布鲁氏菌(b.melitensis)、木鼠布鲁氏菌(b.neotomae)、绵羊布鲁氏菌(b.ovis)、猪布鲁氏菌(b.suis)和鳍型布鲁氏菌(b.pinnipediae)。弗朗西斯菌属(francisella)的种，诸如新凶手弗朗西斯菌(f.novicida)、哲氏弗朗西斯菌(f.philomiragia)和土拉弗朗西斯菌(f.tularensis)；淋病奈瑟球菌(neisseriagonorrhoeae)；杜克雷嗜血杆菌(haemophilusducreyi)；粪肠球菌(enterococcusfaecalis)或屎肠球菌(enterococcusfaecium)；腐生葡萄球菌(staphylococcussaprophyticus)；小肠结肠炎耶尔森氏菌(yersiniaenterocolitica)；结核分支杆菌(mycobacteriumtuberculosis)；单核细胞增多性李斯特氏菌(listeriamonocytogenes)；霍乱弧菌(vibriocholerae)；伤寒沙门氏菌(salmonellatyphi)；博氏疏螺旋体(borreliaburgdorferi)；牙龈卟啉单胞菌(porphyromonasgingivalis)；和克雷白杆菌属(klebsiella)的种。[0525]免疫原来自例如真菌，诸如真菌表面蛋白、真菌膜蛋白、真菌包膜蛋白、真菌内膜蛋白、真菌外膜蛋白、真菌周质蛋白、真菌进入蛋白、真菌膜融合蛋白、真菌结构蛋白、真菌非结构蛋白、分泌型真菌蛋白、真菌聚合酶蛋白、真菌dna聚合酶、真菌rna聚合酶、真菌蛋白酶、真菌糖蛋白、真菌转录因子、真菌酶或真菌毒素。[0526]在一些实施例中，真菌免疫原源自皮肤癣菌(dermatophyte)，包括：絮状表皮癣菌(epidermophytonfloccusum)、头癣小孢霉(microsporumaudouini)、犬小孢霉(microsporumcanis)、畸变小孢霉(microsporumdistortum)、马小孢霉(microsporumequinum)、石膏样小孢霉(microsporumgypsum)、纳米小孢霉(microsporumnanum)、叠瓦毛癣菌(trichophytonconcentricum)、马毛癣菌(trichophytonequinum)、鸡毛癣菌(trichophytongallinae)、石膏样毛癣菌(trichophytongypseum)、麦格尼毛癣菌(trichophytonmegnini)、须毛癣菌(trichophytonmentagrophytes)、昆克努发癣菌(trichophytonquinckeanum)、红色毛癣菌(trichophytonrubrum)、许兰毛癣菌(trichophytonschoenleini)、断发毛癣菌(trichophytontonsurans)、疣状毛癣菌(trichophytonverrucosum)、疣状毛癣菌白色变种(t.verrucosumvar.album)、盘状变种(var.discoides)、赫色变种(var.ochraceum)、紫色毛癣菌(trichophytonviolaceum)和/或蜜块状毛癣菌(trichophytonfaviforme)；或来自于烟曲霉(aspergillusfumigatus)、黄曲霉(aspergillusflavus)、黑曲霉(aspergillusniger)、构巢曲霉(aspergillusnidulans)、土曲霉(aspergillusterreus)、萨氏曲霉(aspergillussydowi)、黄曲霉菌(aspergillusflavatus)、灰绿曲霉(aspergillusglaucus)、芽生裂殖菌(blastoschizomycescapitatus)、白色念珠菌(candidaalbicans)、烯醇化酶念珠菌(candidaenolase)、热带念珠菌(candidatropicalis)、光滑念珠菌(candidaglabrata)、克鲁斯念珠菌(candidakrusei)、近平滑念珠菌(candidaparapsilosis)、类星形念珠菌(candidastellatoidea)、克鲁斯念珠菌(candidakusei)、帕拉克斯念珠菌(candidaparakwsei)、葡萄牙念珠菌(candidalusitaniae)、伪热带念珠菌(candidapseudotropicalis)、季也蒙念珠菌(candidaguilliermondi)、卡氏枝孢霉(cladosporiumcarrionii)、粗球孢子菌(coccidioidesimmitis)、皮炎芽生菌(blastomycesdermatidis)、新型隐球菌(cryptococcusneoformans)、棒地霉(geotrichumclavatum)、荚膜组织胞浆菌(histoplasmacapsulatum)、肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)、微孢子目(microsporidia)、脑胞内原虫属种(encephalitozoonspp.)、肠间隔微孢子虫(septataintestinalis)和毕氏肠微孢子虫(enterocytozoonbieneusi)；不太常见的是小孢子虫属种(brachiolaspp)、微孢子虫属种(microsporidiumspp.)、微粒子虫属种(nosemaspp.)、匹里虫属种(pleistophoraspp.)、气管普孢虫属种(trachipleistophoraspp.)、条孢虫属种(vittaformaspp)、巴西副球孢子菌(paracoccidioidesbrasiliensis)、卡氏肺孢子虫(pneumocystiscarinii)、隐袭腐霉(pythiumninsidiosum)、皮屑芽孢菌(pityrosporumovale)、酿酒酵母(sacharomycescerevisae)、布拉氏酵母(saccharomycesboulardii)、粟酒裂殖酵母(saccharomycespombe)、尖端赛多孢子菌(scedosporiumapiosperum)、申克孢子丝菌(sporothrixschenckii)、白吉利毛孢子菌(trichosporonbeigelii)、刚地弓形虫(toxoplasmagondii)、马尔尼菲青霉(penicilliummarneffei)、马拉色菌属种(malasseziaspp.)、着色真菌属种(fonsecaeaspp.)、万氏霉菌属种(wangiellaspp.)、孢子丝菌属种(sporothrixspp.)、蛙粪霉属种(basidiobolusspp.)、耳霉属种(conidiobolusspp.)、根霉属种(rhizopusspp)、毛霉菌属种(mucorspp)、犁头霉属种(absidiaspp)、被孢霉属种(mortierellaspp)、小克银汉霉属种(cunninghamellaspp)、瓶霉属种(saksenaeaspp.)、链格孢属种(alternariaspp)、弯孢霉属种(curvulariaspp)、长蠕孢属种(helminthosporiumspp)、镰刀菌属种(fusariumspp)、曲霉属种(aspergillusspp)、青霉属种(penicilliumspp)、链核盘菌属种(monoliniaspp)、丝核菌属种(rhizoctoniaspp)、拟青霉属种(paecilomycesspp)、皮司霉属种(pithomycesspp)和枝孢属种(cladosporiumspp)。[0527]免疫原来自例如真核寄生虫表面蛋白、真核寄生虫膜蛋白、真核寄生虫包膜蛋白、真核寄生虫进入蛋白、真核寄生虫膜融合蛋白、真核寄生虫结构蛋白、真核寄生虫非结构蛋白、分泌型真核寄生虫蛋白、真核寄生虫聚合酶蛋白、真核寄生虫dna聚合酶、真核寄生虫rna聚合酶、真核寄生虫蛋白酶、真核寄生虫糖蛋白、真核寄生虫转录因子、真核寄生虫酶或真核寄生虫毒素。[0528]在一些实施例中，免疫原引发针对来自疟原虫属(plasmodium)的寄生虫诸如恶性疟原虫(p.falciparum)、间日疟原虫(p.vivax)、三日疟原虫(p.malariae)或卵形疟原虫(p.ovale)的免疫反应。在一些实施例中，免疫原引发针对来自鱼虱科(caligidae)的寄生虫，特别是来自疮痂鱼虱属(lepeophtheirus)和鱼虱属(caligus)属的那些寄生虫，例如海虱，诸如鲑疮痂鱼虱(lepeophtheirussalmonis)或大马哈鱼虱(caligusrogercresseyi)的免疫反应。在一些实施例中，免疫原引发针对寄生虫刚地弓形虫的免疫反应。[0529]在一些实施例中，免疫原是癌症免疫原(例如，新表位)。例如，免疫原是与以下相关的新抗原和/或新表位：急性白血病、星形细胞瘤、胆道癌(胆管癌)、骨癌、乳腺癌、脑干神经胶质瘤、细支气管肺泡细胞肺癌、肾上腺癌、肛区癌、膀胱癌、内分泌系统癌、食道癌、头或颈癌、肾癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、胸膜/腹膜癌、唾液腺癌、小肠癌、甲状腺癌、输尿管癌、尿道癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、输卵管癌、肾盂癌、阴道癌、外阴癌、宫颈癌、慢性白血病、结肠癌、结直肠癌、皮肤黑色素瘤、室管膜瘤、表皮样肿瘤、尤因氏肉瘤(ewingssarcoma)、胃癌、成胶质细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、血液系统恶性肿瘤、肝细胞癌(肝癌)、肝细胞瘤，霍奇金病(hodgkin'sdisease)、眼内黑色素瘤、卡波西肉瘤(kaposisarcoma)、肺癌、淋巴瘤、成神经管细胞瘤(medulloblastoma)、黑色素瘤、脑膜瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、肌肉癌、中枢神经系统(cns)赘生物、神经元癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、小儿恶性肿瘤、垂体腺瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、软组织肉瘤、神经鞘瘤、皮肤癌、脊柱肿瘤、鳞状细胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、子宫癌或肿瘤及其转移癌，包括上述任何癌症的难治性形式或其任何组合。[0530]在一些实施例中，免疫原是选自以下的肿瘤抗原：(a)睾丸癌抗原，诸如ny-eso-1、ssx2、scp1以及rage、bage、gage和mage家族的多肽，例如gage-1、gage-2、mage-1、mage-2、mage-3、mage-4、mage-5、mage-6和mage-12(这些可用于例如处理黑色素瘤、肺部、头颈、nsclc、乳腺、胃肠道和膀胱肿瘤；(b)突变的抗原，例如p53(与各种实体瘤相关，例如结直肠癌、肺癌、头颈癌)、p21/ras(与例如黑色素瘤、胰腺癌和结直肠癌相关)、cdk4(与例如黑色素瘤相关)、muml(与例如黑色素瘤相关)、半胱天冬酶-8(与例如头颈癌相关)、cia0205(与例如膀胱癌相关)、hla-a2-r1701、β连环蛋白(与例如黑色素瘤相关)、tcr(与例如t细胞非霍奇金淋巴瘤相关)、bcr-abl(与例如慢性髓细胞性白血病相关)、磷酸丙糖异构酶、kia0205、cdc-27和ldlr-fut；(c)过表达的抗原，例如半乳凝素4(与例如结直肠癌相关)、半乳凝素9(与例如霍奇金病相关)、蛋白酶3(与例如慢性髓细胞性白血病相关)、wt1(与例如各种白血病相关)、碳酸酐酶(与例如肾癌相关)、醛缩酶a(与例如肺癌相关)、prame(与例如黑色素瘤相关)、her-2/neu(与例如乳腺癌、结肠癌、肺癌和卵巢癌相关)、乳腺珠蛋白、甲胎蛋白(与例如肝细胞瘤相关)、ksa(与例如结直肠癌相关)、胃泌素(与例如胰腺癌和胃癌相关)、端粒酶催化蛋白、muc-1(与例如乳腺癌和卵巢癌相关)、g-250(与例如肾细胞癌相关)、p53(与例如乳腺癌、结肠癌相关)和癌胚抗原(与例如乳腺癌、肺癌和胃肠道癌诸如结直肠癌相关)；(d)共有抗原，例如黑色素瘤-黑色素细胞分化抗原，诸如mart-1/黑色素a、gploo、mc1r、促黑色素细胞激素受体(melanocyte-stimulatinghormonereceptor)、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白-1/trp1和酪氨酸酶相关蛋白-2/trp2(与例如黑色素瘤相关)；(e)与例如前列腺癌相关的前列腺相关抗原，诸如pap、psa、psma、psh-p1、psm-p1、psm-p2；(f)免疫球蛋白独特型(例如，与骨髓瘤和b细胞淋巴瘤相关)；(g)新抗原。在某些实施例中，肿瘤免疫原包括但不限于pi5、hom/mel-40、h-ras、e2a-prl、h4-ret、igh-igk、myl-rar、爱泼斯坦巴尔病毒抗原、ebna、人乳头瘤病毒(hpv)抗原(包括e6和e7)、乙型肝炎和丙型肝炎病毒抗原、人t细胞淋巴病毒抗原、tsp-180、pl85erbb2、pl80erbb-3、c-met、mn-23hl、tag-72-4、ca19-9、ca72-4、cam17.1、numa、k-ras、pl6、tage、psca、ct7、43-9f、5t4、791tgp72、beta-hcg、bca225、btaa、ca125、ca15-3(ca27.29ybcaa)、ca195、ca242、ca-50、cam43、cd68\kp1、co-029、fgf-5、ga733(epcam)、htgp-175、m344、ma-50、mg7-ag、mov18、nb/70k、ny-co-1、rcas1、sdccag16、ta-90(mac-2结合蛋白亲环蛋白c相关蛋白)、taal6、tag72、tlp、tps等。[0531]在一些实施例中，免疫原引发针对以下物质的免疫反应：花粉过敏原(树木、草本植物、野草和禾木科植物花粉过敏原)；昆虫或蜘蛛纲过敏原(吸入物、唾液和毒液过敏原，例如螨过敏原、蟑螂和蚊虫过敏原、膜翅目毒液过敏原)；动物毛发和头皮屑过敏原(来自于例如狗、猫、马、大鼠、小鼠等)；以及食物过敏原(例如麦醇溶蛋白)。来自树木、禾本科植物和草本植物的重要花粉过敏原是源于以下的此类过敏原：分类的壳斗目(fagales)、木犀目(oleales)、松目(pinales)和悬铃木科(platanaceae)，包括但不限于桦树(桦属(betula))、桤木(桤木属(alnus))、榛树(榛属(corylus))、角树(鹅耳枥属(carpinus))和橄榄(洋橄榄属(olea))、雪松(柳杉属(cryptomeria)和桧属(juniperus))、法国梧桐(悬铃木属(platanus))；禾本目(poales)，包括黑麦草属(lolium)、梯牧草属(phleum)、早熟禾属(poa)、狗牙根属(cynodon)、鸭茅属(dactylis)、绒毛草属(holcus)、虉草属(phalaris)、黑麦属(secale)和高粱属(sorghum)的禾本科植物；菊目(asterales)和荨麻目(urticales)，包括豕草属(ambrosia)、蒿属(artemisia)和墙草属(parietaria)的草本植物。其他重要的吸入性过敏原是来自尘螨属(dermatophagoides)和嗜霉螨属(euroglyphus)的屋尘螨、贮藏螨(例如嗜鳞螨属(lepidoglyphys)、食甜螨属(glycyphagus)和食酪螨属(tyrophagus))的那些过敏原；来自蟑螂、蚊虫和跳蚤，例如如小蠊属(blatella)、大蠊属(periplaneta)、摇蚊属(chironomus)和蚤属(ctenocepphalides)的那些过敏原；以及来自哺乳动物诸如猫、狗和马的那些过敏原；毒液过敏原，包括源于叮或咬的昆虫的此类过敏原，这些昆虫诸如来自分类的膜翅目的那些，包括蜜蜂(蜜蜂科(apidae))、黄蜂(胡蜂科(vespidea))和蚂蚁(蚁科(formicoidae))。[0532]在一些实施例中，免疫原源自例如毒液中的毒素，诸如来自以下的毒液：蛇(例如，大多数响尾蛇的种(例如，东菱斑响尾蛇)、褐蛇的种(例如，褐蛇王和东部褐蛇)、卢氏蝰蛇(russel’sviper)、眼镜蛇(例如，印度眼镜蛇、眼镜王蛇)、金环蛇的某些种(例如，普通金环蛇)、树眼镜蛇(例如，黑色树眼镜蛇)、锯鳞蝰、非洲树蛇、杜布瓦海蛇、太攀蛇的种(例如，海岸太攀蛇和内陆太攀蛇)、锐蝮蛇的种(例如矛头蛇和三色矛头蝮)、巨蝮、铜头蛇、棉口蛇、珊瑚蛇、死亡蛇、贝尔彻海蛇(belcher’sseasnake)、虎蛇、澳大利亚黑蛇)、蜘蛛(例如，褐皮花蛛、黑寡妇毒蛛、巴西流浪蜘蛛、漏斗网蜘蛛、纽扣蜘蛛、澳大利亚赤背蜘蛛、卡提波蜘蛛、假黑寡妇蜘蛛、智利隐士蜘蛛、鼠蜘、粒突蛛属(macrothele)的种、竹蛏属(sicarius)的种、hexpthalma属种、狼蛛(tarantulas)的某些种)、蝎子和其他蛛形纲动物(例如，肥尾蝎、以色列金蝎(deathstalkerscorpion)、印度红蝎、刺尾蝎属(centruroides)的种、钳蝎属(tityus)的种，诸如巴西黄蝎)、昆虫(例如，蜜蜂的种、黄蜂的种、某些蚂蚁(诸如火蚁)、一些鳞翅目毛虫的种、某些蜈蚣的种、桨足虫图伦冥府虾(xibalbanustulumensis))、鱼类(例如某些鲶鱼的种(例如，条纹鳗鲶和其他鳗鲶)、某些黄貂鱼的种类(例如，蓝斑黄貂鱼)、蓑鲉、石鱼、蝎子鱼、蟾鱼、鲭带鱼、虎鲉、帆鳍鲉(cockatoowaspfish)、斑马鳚(stripedblenny)、瞻星鱼(stargazer)、银鲛(chimaera)、鲈鱼(weever)、狗鲨(dogfishshark))、刺胞动物(例如水母的某些种(例如伊鲁康吉水母(irukanjdijellyfish)和箱型水母(boxjellyfish))、水螅虫类(例如，葡萄牙战舰(portuguesemano’war))、海葵、珊瑚的某些种)、蜥蜴(例如，吉拉毒蜥、墨西哥须蜥、巨蜥属(varanus)的某些种(例如，科莫多巨蜥(科莫多巨蜥))、眼斑巨蜥和树巨蜥)、哺乳动物(例如，南部短尾鼩、鸭嘴兽、欧鼹鼠、欧亚水鼩、地中海水鼩、北部短尾鼩、埃利奧特短尾鼩(elliot’sshort-tailedshrew)、沟齿鼩的某些种(例如古巴沟齿鼩(cubansolenodon)、海地沟齿鼩(hispaniolansolenodon))、懒猴(slowloiris))、软体动物(例如，鸡心螺的某些种)、头足类动物(例如，章鱼的某些种(例如，蓝圈章鱼)、鱿鱼和乌贼)、两栖动物(例如，青蛙，诸如箭毒蛙、布鲁诺盔头蛙(bruno’scasque-headedfrog)、绿蛙(greening’sfrog)、蝾螈(例如火蝾螈、伊比利亚有肋蝾螈(iberianribbednewt))。[0533]在一些实施例中，毒素来自植物或真菌(例如蘑菇)。[0534]在一些实施例中，毒素免疫原源自毒素，诸如蓝藻毒素(cyanotoxin)、二甲毒素(dinotoxin)、肌肉毒素、细胞毒素(例如，蓖麻毒蛋白、蜂毒(apitoxin)、霉菌毒素(mycotoxin)(例如，黄曲霉毒素(aflatoxin))、赭曲霉毒素(ochratoxin)、桔青霉素(citrinin)、麦角生物碱、棒曲霉毒素(patulin)、镰刀菌(fusarium)毒素、伏马菌素(fumonisin)、单端孢霉烯(trichothecene)、心脏毒素(cardiotoxin))、河豚毒素(tetrodotoxin)、箭毒蛙毒素(batrachotoxin)、肉毒杆菌毒素a、破伤风毒素a、白喉毒素、二噁英(dioxin)、毒蕈碱、蟾蜍毒素(bufortoxin)、沙林(sarin)、溶血毒素(hemotoxin)、光毒素(phototoxin)、坏死毒素(necrotoxin)、肾毒素(nephrotoxin)和神经毒素(neurotoxin)(例如，钙蛇毒(calciseptine)、眼镜蛇毒蛋白(cobrotoxin)、钙阻蛋白(calcicludine)、筒箭毒-i(fasciculin-i)、钙利毒素(calliotoxin))。[0535]来自多种微生物或癌症的免疫原可以用于环状或线性多核糖核苷酸中。在一些情况下，免疫原与以上披露的一种微生物相关或由其表达。在一些实施例中，免疫原与以上披露的两种或更多种微生物相关或由其表达。在一些情况下，免疫原与以上披露的一种癌症相关或由其表达。在一些实施例中，免疫原与以上披露的两种或更多种癌症相关或由其表达。在一些实施例中，免疫原源自如以上披露的毒素。在一些实施例中，免疫原来自以上披露的两种或更多种毒素。[0536]这两种或更多种微生物是有关的或无关的。在一些情况下，两种或多种微生物在系统发育上有关。例如，本披露的环状或线性多核糖核苷酸包括或编码来自两种或更多种病毒、病毒科的两个或更多个成员、病毒纲的两个或更多个成员、病毒目的两个或更多个成员、病毒属的两个或更多个成员、病毒种的两个或更多个成员、两种或更多种细菌病原体的免疫原。在一些实施例中，两种或多种微生物在系统发育上无关。[0537]在一些情况下，两种或多种微生物在表现上有关。例如，本披露的环状或线性多核糖核苷酸包括或编码来自两种或更多种呼吸道病原体、两种或更多种选择剂、两种或更多种与严重疾病相关的微生物、两种或更多种与免疫受损受试者中的不良结果相关的微生物、两种或更多种与和妊娠有关的不良后果相关的微生物、两种或多种与出血热相关的微生物的免疫原。[0538]本披露的免疫原可以包括野生型序列。当描述免疫原时，术语“野生型”是指天然存在的且由基因组(例如，病毒基因组)编码的序列(例如，核酸序列或氨基酸序列)。一个物种(例如，微生物物种)可以具有一个野生型序列，或者具有两个或更多个野生型序列(例如，在参考微生物基因组中存在一个规范的野生型序列，并且存在由突变产生的其他变体的野生型序列)。[0539]当描述免疫原时，术语“衍生物”和“源自”是指与野生型序列的不同之处在于一个或多个核酸或氨基酸，例如相对于野生型序列含有一个或多个核酸或氨基酸插入、缺失和/或取代的序列(例如，核酸序列或氨基酸序列)。[0540]免疫原衍生物序列是与野生型序列(例如，野生型核酸、蛋白质、免疫原或表位序列)具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的序列。[0541]在一些实施例中，免疫原含有影响所编码的蛋白质的结构的一个或多个氨基酸插入、缺失、取代或其组合。在一些实施例中，免疫原含有影响所编码的蛋白质的功能的一个或多个氨基酸插入、缺失、取代或其组合。在一些实施例中，免疫原含有影响细胞对所编码的蛋白质的表达或加工的一个或多个氨基酸插入、缺失、取代或其组合。[0542]在一些实施例中，免疫原含有影响所编码的免疫原性核酸的结构的一个或多个核酸插入、缺失、取代或其组合。[0543]氨基酸的插入、缺失、取代或其组合可以引入翻译后修饰的位点(例如，引入糖基化、泛素化、磷酸化、亚硝基化、甲基化、乙酰化、酰胺化、羟基化、硫酸化或脂质化位点，或靶向进行裂解的序列)。在一些实施例中，氨基酸的插入、缺失、取代或其组合去除翻译后修饰的位点(例如，去除糖基化、泛素化、磷酸化、亚硝基化、甲基化、乙酰化、酰胺化、羟基化、硫酸化或脂质化位点，或靶向进行裂解的序列)。在一些实施例中，氨基酸的插入、缺失、取代或其组合修饰翻译后修饰的位点(例如，修饰位点以改变糖基化、泛素化、磷酸化、亚硝基化、甲基化、乙酰化、酰胺化、羟基化、硫酸化或脂质化位点，或裂解的效率或特征)。[0544]氨基酸取代可以是保守性或非保守性取代。保守性氨基酸取代可以是一个氨基酸15、15-20或20-25个氨基酸取代。[0549]在一些实施例中，本披露的免疫原衍生物或表位衍生物相对于本文披露的序列(例如，野生型序列)包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代。[0550]这一个或多个氨基酸取代可以处于n端、c端、氨基酸序列内，或为其组合。这些氨基酸取代可以是连续的、非连续的或其组合。[0551]在一些实施例中，本披露的免疫原衍生物或表位衍生物相对于本文披露的序列(例如，野生型序列)包括至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、至多10个、至多11个、至多12个、至多13个、至多14个、至多15个、至多16个、至多17个、至多18个、至多19个、至多20个、至多25个、至多30个、至多35个、至多40个、至多45个、至多50个、至多60个、至多70个、至多80个、至多90个、至多100个、至多120个、至多140个、至多160个、至多180个或至多200个氨基酸缺失。[0552]在一些实施例中，本披露的免疫原衍生物或表位衍生物相对于野生型序列包括1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-15、1-20、1-30、1-40、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、2-15、2-20、2-30、2-40、3-3、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、3-15、3-20、3-30、3-40、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、5-15、5-20、5-30、5-40、10-15、15-20、20-25、20-30、30-50、50-100或100-200个氨基酸缺失。[0553]在一些实施例中，本披露的免疫原衍生物或表位衍生物相对于野生型序列包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸缺失。[0554]这一个或多个氨基酸缺失可以处于n端、c端、氨基酸序列内，或为其组合。这些氨基酸缺失可以是连续的、非连续的或其组合。[0555]在一些实施例中，本披露的免疫原衍生物或表位衍生物相对于野生型序列包括至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个或至少50个氨基酸插入。[0556]在一些实施例中，本披露的免疫原衍生物或表位衍生物相对于野生型序列)包括至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、至多10个、至多11个、至多12个、至多13个、至多14个、至多15个、至多16个、至多17个、至多18个、至多19个、至多20个、至多25个、至多30个、至多35个、至多40个、至多45个或至多50个氨基酸插入。[0557]在一些实施例中，本披露的免疫原衍生物或表位衍生物相对于野生型序列包括1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-15、1-20、1-30、1-40、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、2-15、2-20、2-30、2-40、3-3、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、3-15、3-20、3-30、3-40、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、5-15、5-20、5-30、5-40、10-15、15-20或20-25个氨基酸插入。[0558]在一些实施例中，本披露的免疫原衍生物或表位衍生物相对于野生型序列包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸插入。[0559]这一个或多个氨基酸插入可以处于n端、c端、氨基酸序列内，或为其组合。这些氨基酸插入可以是连续的、非连续的或其组合。[0560]在一些实施例中，免疫原由环状或线性多核糖核苷酸表达。在一些实施例中，免疫原是环状或线性多核糖核苷酸滚环扩增的产物。[0561]免疫原可以大量产生。这样，免疫原可以是可产生的任何蛋白质分子。免疫原可以是可从细胞分泌或定位于细胞的细胞质、细胞核或膜区室的多肽。在一些实施例中，由本披露的环状或线性多核糖核苷酸编码的多肽包括融合蛋白，该融合蛋白包含本文披露的两种或更多种免疫原。在一些实施例中，由本披露的环状或线性多核糖核苷酸编码的多肽包括表位。在一些实施例中，由本披露的环状或线性多核糖核苷酸编码的多肽包括包含本文披露的两个或更多个表位的融合蛋白，例如包含来自本披露的一种或多种微生物的多个预测表位的人工肽序列。[0562]在一些实施例中，可以从环状或线性多核糖核苷酸表达的免疫原是膜蛋白，例如，包括通常作为膜蛋白被发现的多肽序列，或经修饰为膜蛋白的多肽序列。在一些实施例中，可以从本文披露的环状或线性多核糖核苷酸表达的示例性免疫原包括细胞内免疫原或胞质免疫原。[0563]在一些实施例中，免疫原的长度小于约40,000个氨基酸，小于约35,000个氨基酸，小于约30,000个氨基酸，小于约25,000个氨基酸，小于约20,000个氨基酸，小于约15,000个氨基酸小于约10,000个氨基酸，小于约9,000个氨基酸，小于约8,000个氨基酸，小于约7,000个氨基酸，小于约6,000个氨基酸，小于约5,000个氨基酸，小于约4,000个氨基酸，小于约3,000个氨基酸，小于约2,500个氨基酸，小于约2,000个氨基酸，小于约1,500个氨基酸，小于约1,000个氨基酸，小于约900个氨基酸，小于约800个氨基酸，小于约700个氨基酸，小于约600个氨基酸，小于约500个氨基酸，小于约400个氨基酸，小于约300个氨基酸，小于约250个氨基酸，小于约200个氨基酸，小于约150个氨基酸，小于约140个氨基酸，小于约130个氨基酸，小于约120个氨基酸，小于约110个氨基酸，小于约100个氨基酸，小于约90个氨基酸，小于约80个氨基酸，小于约70个氨基酸，小于约60个氨基酸，小于约50个氨基酸，小于约40个氨基酸，小于约30个氨基酸，小于约25个氨基酸，小于约20个氨基酸，小于约15个氨基酸，小于约10个氨基酸，小于约5个氨基酸，介于之间或更小的任何氨基酸长度都可用。[0564]在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括一个或多个免疫原序列并且构造成用于在受试者体内细胞中持续表达。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸构造成使得该一个或多个表达序列在细胞中在较晚的时间点的表达等于或高于较早的时间点的表达。在此类实施例中，该一个或多个免疫原序列的表达可以维持在相对稳定的水平或可以随时间增加。免疫原序列的表达可以在延长的时间段内相对稳定。免疫原序列的表达可以瞬时相对稳定或仅有限的时间，例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天相对稳定。[0565]在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸在受试者中例如瞬时或长期表达一种或多种免疫原。在某些实施例中，免疫原的表达持续至少约1小时至约30天，或至少约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或更长时间或介于之间的任何时间。在某些实施例中，免疫原的表达持续不超过约30分钟至约7天、或不超过约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或介于之间的任何时间。[0566]免疫原表达包括翻译本文提供的环状或线性多核糖核苷酸的至少一个区域。例如，环状或线性多核糖核苷酸可以在受试者中翻译以生成包括本披露的一种或多种免疫原的多肽，从而刺激受试者中适应性免疫反应(例如，抗体反应和/或t细胞反应)的产生。在一些实施例中，本披露的环状或线性多核糖核苷酸经翻译以在人或动物受试者中产生一种或多种免疫原，从而刺激人或动物受试者中适应性免疫反应(例如，抗体反应和/或t细胞反应)的产生。[0567]在一些实施例中，用于免疫原表达的方法包括将环状或线性多核糖核苷酸的总长度的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％翻译成多肽。在一些实施例中，用于免疫原表达的方法包括将环状或线性多核糖核苷酸翻译成具有至少5个氨基酸、至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少50个氨基酸、至少100个氨基酸、至少150个氨基酸、至少200个氨基酸、至少250个氨基酸、至少300个氨基酸、至少400个氨基酸、至少500个氨基酸、至少600个氨基酸、至少700个氨基酸、至少800个氨基酸、至少900个氨基酸或至少1000个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状或线性多核糖核苷酸翻译成约5个氨基酸、约10个氨基酸、约15个氨基酸、约20个氨基酸、约50个氨基酸、约100个氨基酸、约150个氨基酸、约200个氨基酸、约250个氨基酸、约300个氨基酸、约400个氨基酸、约500个氨基酸、约600个氨基酸、约700个氨基酸、约800个氨基酸、约900个氨基酸或约1000个氨基酸的多肽。在一些实施例中，方法包括将环状或线性多核糖核苷酸翻译成本文提供的连续多肽、本文提供的离散多肽或两者。[0568]在一些实施例中，用于免疫原表达的方法包括翻译产物的修饰、折叠或其他翻译后修饰。在一些实施例中，用于免疫原表达的方法包括体内翻译后修饰，例如经由细胞机制。[0569]信号序列[0570]在一些实施例中，可以从本文披露的环状或线性多核糖核苷酸表达的示例性免疫原包括分泌性蛋白，例如天然包括信号序列的蛋白质(例如，免疫原)，或者通常不编码信号序列但修饰为含有信号序列的蛋白质。在一些实施例中，由环状或线性多核糖核苷酸编码的免疫原包括分泌信号。例如，分泌信号可以是分泌性蛋白的天然编码的分泌信号。再如，分泌信号可以是分泌性蛋白的经修饰的分泌信号。在其他实施例中，由环状或线性多核糖核苷酸编码的免疫原不包括分泌信号。[0571]在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸编码相同免疫原的多个拷贝(例如，相同免疫原的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个拷贝)。在一些实施例中，免疫原的至少一个拷贝包括信号序列，且免疫原的至少一个拷贝不包括信号序列。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸编码多个免疫原(例如，多个不同的免疫原或多个具有小于100％序列同一性的免疫原)，其中该多个免疫原中的至少一个包括信号序列且该多个免疫原中的至少一个拷贝不包括信号序列。[0572]在一些实施例中，信号序列是野生型信号序列，其例如在内源表达时存在于相应野生型免疫原的n端。在一些实施例中，信号序列是免疫原异源的，例如当野生型免疫原内源性表达时是不存在的。可以修饰编码免疫原的多核糖核苷酸序列以去除编码野生型信号序列的核苷酸序列和/或添加编码异源信号序列的序列。[0573]环状或线性多核糖核苷酸可进一步包括一种或多种佐剂，每一种佐剂具有或不具有信号序列。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸编码至少一种佐剂和至少一种免疫原。在一些实施例中，该至少一种编码的佐剂包括信号序列且该至少一种编码的免疫原不包括信号序列。在一些实施例中，该至少一种编码的佐剂包括信号序列且该至少一种编码的免疫原包括信号序列。在一些实施例中，该至少一种编码的佐剂不包括信号序列且该至少一种编码的免疫原包括信号序列。在一些实施例中，编码的佐剂和编码的免疫原都不包括信号序列。[0574]在一些实施例中，信号序列是野生型信号序列，其例如在内源表达时存在于相应野生型佐剂的n端。在一些实施例中，信号序列与佐剂异源，例如当野生型佐剂内源性表达时是不存在的。可以修饰编码佐剂的多核糖核苷酸序列以去除编码野生型信号序列的核苷酸序列和/或添加编码异源信号序列的序列。[0575]由多核糖核苷酸编码的多肽(例如，由多核糖核苷酸编码的免疫原或佐剂)可以包括将免疫原或佐剂引导至分泌途径的信号序列。在一些实施例中，信号序列可以引导免疫原或佐剂驻留在某些细胞器(例如，内质网、高基氏体或内体)中。在一些实施例中，信号序列引导免疫原或佐剂从细胞中分泌。对于分泌性蛋白，信号序列可以在分泌后裂解，从而产生成熟蛋白。在其他实施例中，信号序列可以嵌入细胞膜或某些细胞器中，产生跨膜区段，跨膜区段将蛋白锚定至细胞膜、内质网或高基氏体。在某些实施例中，跨膜蛋白的信号序列是在多肽n端的短序列。在其他实施例中，第一跨膜结构域充当第一信号序列，将蛋白质靶向膜。[0576]在一些实施例中，由多核糖核苷酸编码的佐剂包括分泌信号序列。在一些实施例中，由多核糖核苷酸编码的免疫原包括分泌信号序列、跨膜插入信号序列或不包括信号序列。[0577]调控元件[0578]在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括调控元件，例如修饰环状或线性多核糖核苷酸内表达序列的表达的序列。调控元件可以包括位置与编码表达产物的表达序列相邻的序列。调控元件可以可操作地连接至相邻序列。与不存在调控元件时表达的产物的量相比，调控元件可以增加表达的产物的量。调控元件可用于增加由环状或线性多核糖核苷酸编码的一种或多种免疫原和/或佐剂的表达。同样，调控元件可用于减少由环状或线性多核糖核苷酸编码的一种或多种免疫原和/或佐剂的表达。在一些实施例中，一种调控元件可用于增加免疫原和/或佐剂的表达，而另一种调控元件可用于减少相同环状或线性多核糖核苷酸上另一免疫原和/或佐剂的表达。另外，一种调控元件可以增加串联附接的多个表达序列表达的产物(例如，免疫原或佐剂)的量。因此，一种调控元件可以增强一个或多个表达序列(例如，免疫原或佐剂)的表达。也可以使用多种调控元件，例如，差异性地调控不同表达序列的表达。在一些实施例中，本文提供的调控元件可以包括选择性翻译序列。如本文所用，术语“选择性翻译序列”是指在环状或线性多核糖核苷酸中选择性地起始或激活表达序列的翻译的核酸序列，例如某些核糖开关适体酶。调控元件还可以包括选择性降解序列。如本文所用，术语“选择性降解序列”是指起始环状或线性多核糖核苷酸或者环状或线性多核糖核苷酸的表达产物的降解的核酸序列。在一些实施例中，调控元件是翻译调节子。翻译调节子可以调节环状或线性多核糖核苷酸中表达序列的翻译。翻译调节子可以是翻译增强子或翻译抑制子。在一些实施例中，翻译起始序列可以充当调控元件。在国际专利公开号wo2019/118919的段落[0154]-[0161]中描述了调控元件的其他实例，该专利特此通过援引以其全文并入。[0579]与起始翻译的密码子(诸如但不限于起始密码子或替代的起始密码子)侧接的核苷酸已知会影响环状或线性多核糖核苷酸的翻译效率、长度和/或结构。(参见例如matsuda和mauroplosone[公共科学图书馆期刊],20105:11；其内容通过援引以其全文并入本文)。掩蔽与起始翻译的密码子侧接的任何核苷酸可用于改变环状或线性多核糖核苷酸的翻译起始位置、翻译效率、长度和/或结构。[0580]在一个实施例中，可以在起始密码子或替代的起始密码子附近使用掩蔽剂，以掩蔽或隐藏密码子，以降低在被掩蔽的起始密码子或替代的起始密码子处起始翻译的可能性。在另一个实施例中，掩蔽剂可用于掩蔽环状或线性多核糖核苷酸的起始密码子，以增加翻译将在替代的起始密码子处起始的可能性。[0581]翻译起始序列[0582]在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸编码免疫原并且包括翻译起始序列，例如起始密码子。在一些实施例中，翻译起始序列包括科扎克或夏因-达尔加诺(shine-dalgarno)序列。在一些实施例中，翻译起始序列包含科扎克序列。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括与表达序列相邻的翻译起始序列，例如科扎克序列。在一些实施例中，翻译起始序列是非编码起始密码子。在一些实施例中，翻译起始序列(例如科扎克序列)存在于每个表达序列的一侧或两侧，导致表达产物的隔开。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括与表达序列相邻的至少一个翻译起始序列。在一些实施例中，翻译起始序列为环状或线性多核糖核苷酸提供构象柔性。在一些实施例中，翻译起始序列基本上在环状或线性多核糖核苷酸的单链区域内。在国际专利公开号wo2019/118919的段落[0163]-[0165]中描述了翻译起始序列的其他实例，该专利特此通过援引以其全文并入。[0583]环状或线性多核糖核苷酸可以包括多于1个起始密码子，诸如但不限于至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少50个、至少60个或多于60个起始密码子。翻译可以在第一个起始密码子上起始或可以在第一个起始密码子的下游起始。[0584]在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸可以起始于不是第一起始密码子的密码子，例如aug。环状或线性多核糖核苷酸的翻译可以在替代性的翻译起始序列处起始，诸如国际专利公开号wo2019/118919a1的[0164]中描述的那些，该专利公开通过援引以其全文并入本文。[0585]在一些实施例中，翻译是通过用rocaglates处理真核起始因子4a(eif4a)来起始的(通过阻断43s扫描来阻遏翻译，导致过早的上游翻译起始以及携带roca-eif4a靶序列的转录本的蛋白质表达降低，参见例如，www.nature.com/articles/nature17978)。[0586]ires[0587]在一些实施例中，本文所述的环状或线性多核糖核苷酸包括内部核糖体进入位点(ires)元件。在一些实施例中，本文所述的环状或线性多核糖核苷酸包括多于一个(例如，2、3、4和5个)内部核糖体进入位点(ires)元件。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸在每个表达序列的一侧或两侧上包括一个或多个ires序列，导致所得肽和/或多肽的隔开。在一些实施例中，ires侧接至少一个(例如2、3、4、5或更多个)表达序列的两侧。包括在环状或线性多核糖核苷酸中的合适的ires元件可以是能够接合真核核糖体的rna序列。在一些实施例中，ires是脑心肌炎病毒(emcv)ires。在一些实施例中，ires是柯萨奇病毒(coxsackievirus)(cvb3)ires。在国际专利公开号wo2019/118919的段落[0166]-[0168]中描述了ires的其他实例，该专利公开特此通过援引以其全文并入。[0588]裂解结构域[0589]本披露的环状或线性多核糖核苷酸可以包括裂解结构域(例如，交错元件或裂解序列)。[0590]术语“交错元件”是指在翻译期间诱导核糖体暂停的部分，诸如核苷酸序列。在一些实施例中，交错元件是具有强α-螺旋倾向的氨基酸的非保守序列，然后是共有序列-d(v/i)exnpgp，其中x＝任何氨基酸(seqidno:7)。在一些实施例中，交错元件可以包括化学部分，如甘油、非核酸连接部分、化学修饰、经修饰的核酸或其任何组合。[0591]在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括与表达序列相邻的至少一个交错元件。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括与每个表达序列相邻的交错元件。在一些实施例中，交错元件存在于每个表达序列的一侧或两侧，导致例如一种或多种免疫原和/或一种或多种佐剂的表达产物的隔开。在一些实施例中，交错元件是一个或多个表达序列的一部分。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包含一个或多个表达序列(例如，一种或多种免疫原和/或一种或多种佐剂)，并且该一个或多个表达序列中的每一个通过环状或线性多核糖核苷酸上的交错元件与后继的表达序列(例如，一种或多种免疫原和/或一种或多种佐剂)隔开。在一些实施例中，交错元件阻止(a)单个表达序列的两轮翻译或(b)两个或更多个表达序列的一轮或多轮翻译生成单个多肽。在一些实施例中，交错元件是与该一个或多个表达序列隔开的序列。在一些实施例中，交错元件包括该一个或多个表达序列的表达序列的一部分。[0592]在国际专利公开号wo2019/118919的段落[0172]-[0175]中描述了交错元件的实例，该专利公开特此通过援引以其全文并入。[0593]在一些实施例中，由环状或线性核糖核苷酸编码的该多种免疫原可以被每个免疫原之间的ires隔开。所有免疫原之间的ires可以是相同的ires。不同免疫原之间的ires可以不同。在其他实施例中，该多种免疫原和/或佐剂可以被2a自裂解肽隔开。此外，由环状或线性核糖核苷酸编码的该多种免疫原和/或佐剂可被ires和2a序列分开。例如，ires可以在一个免疫原和/或佐剂与第二免疫原和/或佐剂之间，而2a肽可以在第二免疫原和/或佐剂与第三免疫原和/或佐剂之间。特定ires或2a自裂解肽的选择可用于在ires或2a序列的控制下控制免疫原和/或佐剂的表达水平。例如，根据所选择的ires和/或2a肽，多肽上的表达可以更高或更低。[0594]为了避免产生连续表达产物，例如免疫原和/或佐剂，同时保持滚环翻译，可以包括交错元件以在翻译期间诱导核糖体暂停。在一些实施例中，交错元件在一个或多个表达序列中的至少一个的3'端。交错元件可以构造为在环状或线性多核糖核苷酸的滚环翻译期间使核糖体停滞。交错元件可以包括但不限于2a样或chysel(seqidno:8)(顺式作用的水解酶元件)序列。在一些实施例中，交错元件编码具有c末端共有序列为x1x2x3ex5npgp的序列，其中x1不存在或g或h，x2不存在或d或g，x3是d或v或i或s或m，x5是任何氨基酸(seqidno:9)。在一些实施例中，该序列包括具有强α-螺旋倾向的氨基酸的非保守序列，然后是共有序列-d(v/i)exnpgp，其中x＝任何氨基酸(seqidno:7)。交错元件的一些非限制性实例包括gdvesnpgp(seqidno:10)、gdieenpgp(seqidno:11)、vepnpgp(seqidno:12)、ietnpgp(seqidno:13)、gdiesnpgp(seqidno:14)、gdvelnpgp(seqidno:15)、gdietnpgp(seqidno:16)、gdvenpgp(seqidno:17)、gdveenpgp(seqidno:18)、gdveqnpgp(seqidno:19)、iesnpgp(seqidno:20)、gdielnpgp(seqidno:21)、hdietnpgp(seqidno:22)、hdvetnpgp(seqidno:23)、hdvemnpgp(seqidno:24)、gdmesnpgp(seqidno:25)、gdvetnpgp(seqidno:26)、gdieqnpgp(seqidno:27)和dsefnpgp(seqidno:28)。[0595]在一些实施例中，本文所述的交错元件裂解表达产物，诸如在本文所述的共有序列的g和p之间。作为一个非限制性实例，环状或线性多核糖核苷酸包括至少一个交错元件以裂解表达产物。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括与至少一个表达序列相邻的交错元件。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括在每个表达序列后的交错元件。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括存在于每个表达序列的一侧或两侧的交错元件，导致由每个表达序列翻译一种或多种个体肽和/或多肽。[0596]在一些实施例中，交错元件包括一种或多种在翻译过程中诱导核糖体暂停的经修饰的核苷酸或非天然核苷酸。非天然核苷酸可以包括肽核酸(pna)、吗啉代和锁核酸(lna)、以及乙二醇核酸(gna)和苏糖核酸(tna)。诸如此类的实例通过改变分子主链而不同于天然存在的dna或rna。示例性修饰可以包括对糖、核碱基、核苷间键(例如对连接的磷酸酯/对磷酸二酯键/对磷酸二酯主链)进行的可在翻译期间诱导核糖体暂停的任何修饰以及其任何组合。本文提供的一些示例性修饰在本文其他处描述。[0597]在一些实施例中，交错元件以其他形式存在于环状或线性多核糖核苷酸中。例如，在一些示例性的环状或线性多核糖核苷酸中，交错元件包括环状或线性多核糖核苷酸中的第一表达序列的终止元件，和隔开该终止元件与第一表达序列后继表达的第一翻译起始序列的核苷酸间隔序列。在一些实例中，第一表达序列的第一交错元件在环状或线性多核糖核苷酸中的第一表达序列后继表达的第一翻译起始序列的上游(5')。在一些情况下，第一表达序列和第一表达序列后继表达序列是环状或线性多核糖核苷酸中的两个隔开的表达序列。第一交错元件和第一翻译起始序列之间的距离可以使得第一表达序列及其后继表达序列能够连续翻译。在一些实施例中，第一交错元件包括终止元件，并将第一表达序列的表达产物与其后继表达序列的表达产物隔开，从而产生离散的表达产物。在一些情况下，在环状或线性多核糖核苷酸中后继序列的第一翻译起始序列上游包括第一交错元件的环状或线性多核糖核苷酸被连续翻译，而在第二表达序列后继表达序列的第二翻译起始序列的上游包括第二表达序列的交错元件的对应环状或线性多核糖核苷酸不被连续翻译。在一些情况下，环状或线性多核糖核苷酸中仅存在一个表达序列，并且第一表达序列及其后继表达序列是相同的表达序列。在一些示例性的环状或线性多核糖核苷酸中，交错元件包括环状或线性多核糖核苷酸中第一表达序列的第一终止元件，和隔开终止元件与下游翻译起始序列的核苷酸间隔序列。在一些此类实例中，环状或线性多核糖核苷酸中第一交错元件在第一表达序列的第一翻译起始序列的上游(5')。在一些情况下，第一交错元件和第一翻译起始序列之间的距离使得能够连续翻译第一表达序列和任何后继表达序列。在一些实施例中，第一交错元件将第一表达序列的一轮表达产物与第一表达序列的下一轮表达产物分开，从而产生离散的表达产物。在一些情况下，在环状或线性多核糖核苷酸中的第一表达序列的第一翻译起始序列上游包括第一交错元件的环状或线性多核糖核苷酸被连续翻译，而在相应环状或线性多核糖核苷酸中的第二表达序列的第二翻译起始序列上游包括交错元件的相应环状或线性多核糖核苷酸不被连续翻译。在一些情况下，相应环状或线性多核糖核苷酸中第二交错元件与第二翻译起始序列之间的距离是环状或线性多聚核苷酸中第一交错元件与第一翻译起始序列之间的距离的至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在一些情况下，第一交错元件与第一翻译起始之间的距离为至少2nt、3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、55nt、60nt、65nt、70nt、75nt或更大。在一些实施例中，第二交错元件与第二翻译起始之间的距离为至少2nt、3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、55nt、60nt、65nt、70nt、75nt或大于第一交错元件和第一翻译起始之间的距离。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括多于一个表达序列。[0598]在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括至少一个裂解序列。在一些实施例中，裂解序列与表达序列相邻。在一些实施例中，裂解序列在两个表达序列之间。在一些实施例中，裂解序列包括在表达序列中。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括2至10个裂解序列。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括2至5个裂解序列。在一些实施例中，多个裂解序列在多个表达序列之间；例如，环状或线性多核糖核苷酸可以包括三个表达序列和两个裂解序列，使得在每个表达序列之间存在一个裂解序列。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括裂解序列，例如在牺牲型circrna或可裂解的circrna或自裂解的circrna中。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括两个或更多个裂解序列，导致将环状或线性多核糖核苷酸分离成多个产物，例如mirna、线性rna、较小的环状或线性多核糖核苷酸等。[0599]在一些实施例中，裂解序列包括核酶rna序列。核酶(来自核糖核酸酶，也称为rna酶或催化性rna)是催化化学反应的rna分子。许多天然核酶催化其自身的磷酸二酯键之一的水解，或催化其他rna中的键的水解，但也发现天然核酶催化核糖体的氨基转移酶活性。催化性rna可以通过体外方法“进化”。类似于上文讨论的核糖开关活性，核酶及其反应产物可以调控基因表达。在一些实施例中，将催化性rna或核酶置于较大的非编码rna中，这使得核酶以许多拷贝存在于细胞内，用于大体积分子的化学转化的目的。在一些实施例中，适体和核酶都可以在相同的非编码rna中编码。[0600]在一些实施例中，裂解序列编码可裂解的多肽接头。例如，多核糖核苷酸可以编码两种或更多种免疫原，例如，其中该两种或更多种免疫原由单个开放阅读框(orf)编码。例如，两种或更多种免疫原可以由单个开放阅读框编码，该开放阅读框的表达受ires控制。在一些实施例中，orf进一步编码多肽接头，例如使得orf的表达产物编码两种或更多种免疫原，每种免疫原被编码多肽接头的序列(例如，5-200、5至100、5至50、5至20、50至100或50至200个氨基酸的接头)隔开。多肽接头可以包括裂解位点，例如被蛋白酶(例如，在向受试者施用多核糖核苷酸后受试者中的内源蛋白酶)识别并裂解的裂解位点。在此类实施例中，包括两种或更多种免疫原的氨基酸序列的单一表达产物在表达时裂解，从而使得该两种或更多种免疫原在表达后分离。示例性的蛋白酶裂解位点是本领域技术人员已知的，例如，充当被金属蛋白酶(例如，基质金属蛋白酶(mmp)，诸如mmp1-28中的任一种或多种)、解聚素(disintegrin)和金属蛋白酶(adam，诸如adam2、7-12、15、17-23、28-30和33中的任一种或多种)、丝氨酸蛋白酶、尿激酶型纤溶酶原激活剂、蛋白裂解酶(matriptase)、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶或组织蛋白酶识别的蛋白酶裂解位点的氨基酸序列。在一些实施例中，该蛋白酶是mmp9和/或mmp2。在一些实施例中，该蛋白酶是蛋白裂解酶。[0601]在一些实施例中，本文所述的环状或线性多核糖核苷酸是牺牲型环状或线性多核糖核苷酸、可裂解的环状或线性多核糖核苷酸或自裂解的环状或线性多核糖核苷酸。环状或线性多核糖核苷酸可以递送细胞组分，包括，例如，rna、lncrna、lincrna、mirna、trna、rrna、snorna、ncrna、sirna或shrna。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括被以下隔开的mirna：(i)可自裂解的元件；(ii)裂解募集位点；(iii)可降解接头；(iv)化学接头；和/或(v)间隔序列。在一些实施例中，circrna包括被以下隔开的sirna：(i)可自裂解的元件；(ii)裂解募集位点(例如adar)；(iii)可降解接头(例如丙三醇)；(iv)化学接头；和/或(v)间隔序列。可自裂解的元件的非限制性实例包括锤头结构、剪接元件、发夹、丁型肝炎病毒(hdv)、varkud卫星(vs)和glms核酶。[0602]调控元件及表达产物比率[0603]在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括一个或多个调控核酸序列或包括一个或多个编码调控核酸(例如，修饰内源基因和/或外源基因的表达的核酸)的表达序列。在一些实施例中，本文提供的环状或线性多核糖核苷酸的表达序列可以包括与调控核酸(像非编码rna诸如但不限于trna、lncrna、mirna、rrna、snrna、微小rna、sirna、pirna、snorna、snrna、exrna、scarna、yrna和hnrna)反义的序列。[0604]在国际专利公开号wo2019/118919的段落[0177]-[0194]中描述了示例性调控核酸，该专利公开特此通过援引以其全文并入。[0605]在一些实施例中，本文提供的环状多核糖核苷酸的翻译效率大于参考物，例如用于环化的线性对应物、线性表达序列或线性多核糖核苷酸。在一些实施例中，本文提供的环状多核糖核苷酸具有的翻译效率高于参考物的翻译效率至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、600％、70％、800％、900％、1000％、2000％、5000％、10000％、100000％或更高。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的翻译效率高于线性对应物的翻译效率10％。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的翻译效率高于线性对应物的翻译效率300％。[0606]在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸产生化学计量比的表达产物。滚环翻译连续地以基本上相等的比率产生表达产物。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸具有化学计量的翻译效率，使得表达产物以基本上相等的比率产生。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸具有多种表达产物(例如来自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个表达序列的产物)的化学计量翻译效率。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸产生基本上不同比率的表达产物。例如，多种表达产物的翻译效率可以具有1:10,000、1:7000、1:5000、1:1000、1:700、1:500、1:100、1:50、1:10、1:5、1:4、1:3或1:2的比率。在一些实施例中，可以使用调控元件来修改多个表达产物的比率。[0607]翻译[0608]在一些实施例中，一旦起始环状多核糖核苷酸的翻译，在完成环状多核糖核苷酸的至少一轮翻译之前，结合至环状多核糖核苷酸的核糖体不会与环状多核糖核苷酸脱离。在一些实施例中，如本文所述的环状多核糖核苷酸能够滚环翻译。在一些实施例中，在滚环翻译期间，一旦起始环状多核糖核苷酸的翻译，在完成环状多核糖核苷酸的至少2轮、至少3轮、至少4轮、至少5轮、至少6轮、至少7轮、至少8轮、至少9轮、至少10轮、至少11轮、至少12轮、至少13轮、至少14轮、至少15轮、至少20轮、至少30轮、至少40轮、至少50轮、至少60轮、至少70轮、至少80轮、至少90轮、至少100轮、至少150轮、至少200轮、至少250轮、至少500轮、至少1000轮、至少1500轮、至少2000轮、至少5000轮、至少10000轮、至少105轮或至少106轮翻译之前，结合至环状多核糖核苷酸的核糖体不会与环状多核糖核苷酸脱离。[0609]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的滚环翻译导致生成多肽产物，该多肽产物由环状多核糖核苷酸的多于一轮翻译得出(“连续”表达产物)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括交错元件，并且环状多核糖核苷酸的滚环翻译导致生成多肽产物，该多肽产物由环状多核糖核苷酸的单轮翻译或少于单轮翻译生成(“离散”表达产物)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸被构造为使得环状多核糖核苷酸的滚环翻译期间生成的总多肽(摩尔/摩尔)中的至少10％、20％、30％、40％、50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％是离散多肽。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸构造成使得总多肽的至少99％是离散多肽。在一些实施例中，在体外翻译系统中测试离散产物相对于总多肽的量比。在一些实施例中，用于测试量比的体外翻译系统包括兔网织红细胞裂解物。在一些实施例中，在体内翻译系统如真核细胞或原核细胞、培养细胞或生物体中的细胞中测试量比。[0610]非翻译区[0611]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括非翻译区(utr)。包括基因的基因组区域的utr可以转录但不翻译。在一些实施例中，utr可以被包括在本文所述的表达序列的翻译起始序列的上游。在一些实施例中，utr可以被包括在本文所述的表达序列的下游。在一些情况下，第一表达序列的一个utr与第二表达序列的另一个utr相同或连续或重叠。在一些实施例中，内含子是人内含子。在一些实施例中，内含子是全长人内含子，例如zkscan1。[0612]在国际专利公开号wo2019/118919的段落[0197]-[201]中描述了示例性非翻译区，该专利公开特此通过援引以其全文并入。[0613]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括聚a序列。在国际专利公开号wo2019/118919的段落[0202]-[0205]中描述了示例性聚a序列，该专利公开特此通过援引以其全文并入。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少聚a序列。[0614]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括内嵌有一段或多段的腺苷和尿苷的utr。这些au富集签名可能会增加表达产物的转化率。[0615]富含utrau的元件(are)的引入、去除或修饰可用于调节环状多核糖核苷酸的稳定性或免疫原性(例如，免疫或炎性反应的一种或多种标志物的水平)。工程化特定的环状多核糖核苷酸时，可以将are的一个或多个拷贝引入环状多核糖核苷酸中，并且are的这些拷贝可以调节表达产物的翻译和/或产生。同样，可以对are进行鉴别和去除或工程化至环状多核糖核苷酸以调节细胞内稳定性，从而影响所得蛋白质的翻译和产生。[0616]应当理解，可以将来自任何基因的任何utr掺入环状多核糖核苷酸的相应侧翼区中。[0617]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少5'-utr，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少3'-utr，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少聚a序列，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少终止元件，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少内部核糖体进入位点，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少帽，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少5'-utr、3'-utr和ires，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸进一步包括以下序列中的一个或多个：编码一个或多个mirna的序列、编码一个或多个复制蛋白的序列、编码外源基因的序列、编码治疗剂的序列、调控元件(例如翻译调节子，例如翻译增强子或抑制子)、翻译起始序列、靶向内源基因(例如，sirna、lncrna、shrna)的一种或多种调控核酸和编码治疗性mrna或蛋白质的序列。[0618]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少5'-utr。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少3'-utr。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少聚a序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少终止元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少内部核糖体进入位点。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少核酸外切酶的降解易感性。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少降解易感性的事实可能意味着环状多核糖核苷酸不被核酸外切酶降解，或在仅存在核酸外切酶时被降解的有限程度例如与不存在核酸外切酶时相当或相似。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸不被核酸外切酶降解。在一些实施例中，当暴露于核酸外切酶时，环状多核糖核苷酸降解减少。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少与帽结合蛋白的结合。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少5’帽。[0619]终止序列[0620]环状多核糖核苷酸可以包括一个或多个表达序列(例如，编码免疫原和/或编码佐剂)，并且每个表达序列可以具有或可以不具有终止元件。在国际专利公开号wo2019/118919的段落[0169]-[0170]中描述了终止元件的其他实例，该专利特此通过援引以其全文并入。[0621]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括聚a序列。在一些实施例中，聚a序列的长度大于10个核苷酸。在一个实施例中，聚a序列的长度大于15个核苷酸(例如，至少或大于约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500和3,000个核苷酸)。在一些实施例中，根据国际专利公开号wo2019/118919a1的[0202]-[0204]中聚a序列的描述设计聚a序列，该专利公开通过援引以其全文并入本文。[0622]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括聚a、缺少聚a或具有经修饰的聚a以调节环状多核糖核苷酸的一种或多种特征。在一些实施例中，缺少聚a或具有经修饰的聚a的环状多核糖核苷酸改善了一种或多种功能特征，例如免疫原性(例如，免疫或炎性反应的一种或多种标志物的水平)、半衰期、表达效率等。[0623]调控核酸[0624]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一种或多种编码调控核酸(例如，修饰内源基因和/或外源基因的表达的核酸)的表达序列。在一些实施例中，本文提供的环状多核糖核苷酸的表达序列可以包括与调控核酸(像非编码rna诸如但不限于trna、lncrna、mirna、rrna、snrna、微小rna、sirna、pirna、snorna、snrna、exrna、scarna、yrna和hnrna)反义的序列。[0625]在一个实施例中，调控核酸靶向基因，诸如宿主基因。调控核酸可以包括国际专利公开号wo2019/118919a1的[0177]和[0181]-[0189]中描述的任何调控核酸，该专利公开通过援引以其全文并入本文。[0626]在一些实施例中，表达序列包括本文所述的一种或多种特征，例如，编码一种或多种肽或蛋白质的序列、一种或多种调控元件、一种或多种调控核酸(例如一种或多种非编码rna)、其他表达序列及其任何组合。[0627]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个rna结合位点。微小rna(或mirna)是短非编码rna，可与核酸分子的3'utr结合并通过降低核酸分子的稳定性或通过抑制翻译来下调基因表达。环状多核糖核苷酸可以包括一个或多个微小rna靶序列、微小rna序列或微小rna种子。此类序列可以对应于任何已知的微小rna，如在美国公开us2005/0261218和美国公开us2005/0059005中传授的那些，其内容通过援引以其全文并入本文。微小rna序列包括“种子”区，即成熟微小rna的第2-8位区域中的序列，该序列与mirna靶序列具有完美的沃森-克里克互补性。微小rna种子可以包括成熟微小rna的第2-8位或第2-7位。在一些实施例中，微小rna种子可以包括7个核苷酸(例如成熟微小rna的第2-8个核苷酸)，其中相应mirna靶标中的种子互补位点侧接与微小rna第1位相对的腺嘌呤(a)。在一些实施例中，微小rna种子可以包括6个核苷酸(例如成熟微小rna的第2-7个核苷酸)，其中相应mirna靶标中的种子互补位点侧接与微小rna第1位相对的腺嘌呤(a)。参见例如，grimson等人；molcell[分子细胞].20076；27:91-105；通过援引以其全文并入本文。[0628]蛋白质结合[0629]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个蛋白质结合位点，使得蛋白质例如核糖体能够结合至rna序列中的内部位点。通过将蛋白质结合位点(例如核糖体结合位点)工程化至环状多核糖核苷酸中，环状多核糖核苷酸可以逃避或更少地被宿主的免疫系统检测到，通过掩蔽宿主免疫系统成分中的环状多核糖核苷酸来调节降解或调节翻译。[0630]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括至少一个免疫蛋白结合位点，例如用于逃避免疫反应，例如ctl(细胞毒性t淋巴细胞)反应。在一些实施例中，免疫蛋白结合位点是结合至免疫蛋白并有助于将环状多核糖核苷酸掩蔽为外源的核苷酸序列。在一些实施例中，免疫蛋白结合位点是结合至免疫蛋白并有助于将环状多核糖核苷酸隐藏为外源或外来的核苷酸序列。[0631]核糖体与线性rna接合的传统机制包括核糖体与rna的加帽5'端的结合。从5’端，核糖体迁移到起始密码子，于是形成第一肽键。根据本披露，环状多核糖核苷酸的翻译的内部起始(即，不依赖帽)不需要游离末端或加帽端。准确的说，核糖体结合至未加帽的内部位点，由此核糖体在起始密码子处开始多肽延长。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个rna序列，该rna序列包括核糖体结合位点，例如起始密码子。[0632]天然5'utr具有在翻译起始中起作用的特征。它们带有类似科扎克序列的签名，这些序列众所周知参与核糖体起始多种基因的翻译的过程。科扎克序列具有共有ccr(a/g)ccaugg(seqidno:29)，其中r是起始密码子(aug)的三个碱基上游的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，后接另一个“g”。还已知5'utr形成参与延长因子结合的二级结构。[0633]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸编码与蛋白质结合的蛋白质结合序列。在一些实施例中，蛋白质结合序列靶向环状多核糖核苷酸或将其定位至特定靶标。在一些实施例中，蛋白结合序列特异性结合蛋白的精氨酸富集区。[0634]在一些实施例中，蛋白质结合位点包括但不限于与蛋白质的结合位点，如acin1、ago、apobec3f、apobec3g、atxn2、auh、bccip、caprin1、celf2、cpsf1、cpsf2、cpsf6、cpsf7、cstf2、cstf2t、ctcf、ddx21、ddx3、ddx3x、ddx42、dgcr8、eif3a、eif4a3、eif4g2、elavl1、elavl3、fam120a、fbl、fip1l1、fkbp4、fmr1、fus、fxr1、fxr2、gnl3、gtf2f1、hnrnpa1、hnrnpa2b1、hnrnpc、hnrnpk、hnrnpl、hnrnpm、hnrnpu、hnrnpul1、igf2bp1、igf2bp2、igf2bp3、ilf3、khdrbs1、larp7、lin28a、lin28b、m6a、mbnl2、mettl3、mov10、msi1、msi2、nono、nono-、nop58、npm1、nudt21、pcbp2、polr2a、prpf8、ptbp1、rbfox2、rbm10、rbm22、rbm27、rbm47、rnps1、safb2、sbds、sf3a3、sf3b4、sirt7、slbp、sltm、smndc1、snd1、srrm4、srsf1、srsf3、srsf7、srsf9、taf15、tardbp、tia1、tnrc6a、top3b、tra2a、tra2b、u2af1、u2af2、unk、upf1、wdr33、xrn2、ybx1、ythdc1、ythdf1、ythdf2、ywhag、zc3h7b、pdk1、akt1和任何其他结合rna的蛋白质。[0635]加密原[0636]如本文所述，环状多核糖核苷酸包括加密原以减少、逃避或避免细胞先天免疫反应。在一方面，本文提供了环状多核糖核苷酸，当该环状多核糖核苷酸被递送至细胞时，与由参考化合物(例如对应于所述环状多核糖核苷酸的线性多核苷酸或缺少加密原的环状多核糖核苷酸)引发的反应相比，导致宿主的免疫反应减少。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的免疫原性小于(例如，免疫或炎性反应的一种或多种标记物的水平低于)缺少加密原的对应物的免疫原性。[0637]在一些实施例中，加密原增强了稳定性。关于utr在核酸分子的稳定性和翻译方面发挥调控作用的证据越来越多。utr的调控特征可以包含在加密原中，以增强环状多核糖核苷酸的稳定性。[0638]在一些实施例中，5'-或3'-utr可以构成环状多核糖核苷酸中的加密原。例如，富含utrau的元件(are)的去除或修饰可用于调节环状多核糖核苷酸的稳定性或免疫原性(例如，调节免疫或炎性反应的一种或多种标志物的水平)。[0639]在一些实施例中，表达序列，例如可翻译区中au富集元件(are)的去除或修饰可用于调节环状多核糖核苷酸的稳定性或免疫原性(例如，调节免疫或炎性反应的一种或多种标记物的水平)。[0640]在一些实施例中，加密原包括mirna结合位点或与任何其他非编码rna的结合位点。例如，将mir-142位点掺入本文所述的环状多核糖核苷酸中不仅可调节造血细胞中的表达，还可减少或消除对环状多核糖核苷酸编码的蛋白质的免疫反应。[0641]在一些实施例中，加密原包括一个或多个蛋白质结合位点，使得蛋白质(例如免疫蛋白质)能够结合至rna序列。通过将蛋白质结合位点工程化至环状多核糖核苷酸中，环状多核糖核苷酸可以逃避或更少地被宿主的免疫系统检测到，通过掩蔽宿主免疫系统成分中的环状多核糖核苷酸来调节降解或调节翻译。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括至少一个免疫蛋白结合位点，例如用于逃避免疫反应，例如ctl反应。在一些实施例中，免疫蛋白结合位点是结合至免疫蛋白并有助于将环状多核糖核苷酸掩蔽为外源的核苷酸序列。[0642]在一些实施例中，加密原包括一种或多种经修饰的核苷酸。示例性修饰可以包括对糖、核碱基、核苷间键(例如至连接的磷酸酯/至磷酸二酯键/至磷酸二酯主链)进行的可防止或减少针对环状多核糖核苷酸的免疫反应的任何修饰以及其任何组合。本文提供了一些示例性修饰。[0643]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一种或多种如本文其他处所述的修饰，以与由参考化合物(例如缺少修饰的环状多核糖核苷酸)引发的反应相比，减少宿主的免疫反应。特别地，已显示添加一个或多个肌苷区分rna是内源性还是病毒性。参见例如yu,z等人,(2015)rnaeditingbyadar1marksdsrnaas“self”[通过adar1进行的rna编辑将dsrna标记为“自身”].cellres[细胞研究].25,1283-1284，其通过援引以其全文并入本文。[0644]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个shrna的表达序列或可被加工成sirna的rna序列，并且shrna或sirna靶向rig-i并降低rig-i的表达。rig-i可以感知外源环状rna并引起外源环状rna的降解。因此，具有靶向rig-1的shrna、sirna或任何其他调控核酸的序列的环状多核苷酸可降低针对环状多核糖核苷酸的免疫力，例如宿主细胞免疫力。[0645]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少有助于环状多核糖核苷酸减少、逃避或避免细胞先天免疫反应的序列、元件或结构。在一些此类实施例中，环状多核糖核苷酸可能缺少聚a序列、5'端、3'端、磷酸基、羟基或其任何组合。[0646]核苷酸间隔序列[0647]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括间隔序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括至少一个间隔序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括1、2、3、4、5、6、7或更多个间隔序列。[0648]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括间隔序列。在一些实施例中，多核糖核苷酸的元件可以通过间隔序列或接头彼此隔开。在国际专利公开号wo2019/118919的段落[0293]-[0302]中描述了示例性的间隔序列，该专利公开特此通过援引以其全文并入。[0649]非核酸接头[0650]本文所述的环状多核糖核苷酸可以包括非核酸接头。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在本文所述的一个或多个序列或元件之间具有非核酸接头。在一个实施例中，本文所述的一个或多个序列或元件与接头连接。非核酸接头可以是化学键，例如一个或多个共价键或非共价键。在一些实施例中，非核酸接头是肽接头或蛋白接头。此类接头可以在2-30个氨基酸之间，或更长。本文所述的环状多核糖核苷酸还可以包括非核酸接头。在国际专利公开号wo2019/118919的段落[0303]-[0307]中描述了示例性的非核酸接头，该专利公开特此通过援引以其全文并入。[0651]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸进一步包括另一种核酸序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括其他序列，其包括dna、rna或人工核酸。其他序列可以包括但不限于基因组dna，cdna或编码trna、mrna、rrna、mirna、grna、sirna或其他rnai分子的序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括sirna，以靶向与环状多核糖核苷酸相同的基因表达产物的不同基因座。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括sirna，以靶向与环状多核糖核苷酸中存在的基因表达产物不同的基因表达产物。[0652]稳定性和半衰期[0653]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括特定的序列特征。例如，环状多核糖核苷酸可以包括特定的核苷酸组成。在一些此类实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括一个或多个嘌呤(腺嘌呤和/或鸟苷)富集区。在一些此类实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括一个或多个嘌呤富集区。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括一个或多个au富集区或元件(are)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括一个或多个腺嘌呤富集区。[0654]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括本文其他处所述的一个或多个重复元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个本文其他处所述的修饰。[0655]环状多核糖核苷酸相对于参考序列可以包括一个或多个取代、插入和/或添加、缺失和共价修饰。例如，相对于亲本多核糖核苷酸具有一个或多个插入、添加、缺失和/或共价修饰的环状多核糖核苷酸包括在本披露的范围内。在国际专利公开号wo2019/118919的段落[0310]-[0325]中描述了示例性修饰，该专利公开特此通过援引以其全文并入。[0656]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括高阶结构，例如二级或三级结构。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的互补区段将其自身折叠成双链区段，与氢键结合配对(例如，a-u和c-g)。在一些实施例中，螺旋，也称为茎，在分子内形成，具有连接至端环的双链区段。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有至少一个具有准双链二级结构的区段。[0657]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的一个或多个序列包括基本上单链的与双链的区域。在一些实施例中，单链与双链的比率可以影响环状多核糖核苷酸的功能。[0658]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的一个或多个序列基本上是单链的。在一些实施例中，基本上单链的环状多核糖核苷酸的一个或多个序列可以包括蛋白质或rna结合位点。在一些实施例中，基本上单链的环状多核糖核苷酸序列可以是构象柔性的以允许增加相互作用。在一些实施例中，有目的地将环状多核糖核苷酸的序列工程化以包括此类二级结构，从而结合或增加蛋白质或核酸结合。[0659]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸基本上是双链的。在一些实施例中，基本上双链的环状多核糖核苷酸的一个或多个序列可以包括构象识别位点，例如核糖开关或适体酶。在一些实施例中，基本上双链的环状多核糖核苷酸序列可以是构象刚性的。在一些此类实例中，构象刚性序列可能在空间上阻碍环状多核糖核苷酸结合蛋白质或核酸。在一些实施例中，有目的地将环状多核糖核苷酸的序列工程化以包括此类二级结构，从而避免或减少蛋白质或核酸结合。[0660]有16种可能的碱基对，但是其中的六种(au、gu、gc、ua、ug、cg)可能形成实际的碱基对。其余的称为不匹配，以极低的频率出现在螺旋中。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的结构不容易被破坏，不影响其功能且无致命后果，这提供了保持二级结构的选择。在一些实施例中，茎的一级结构(即其核苷酸序列)仍可变化，同时仍保持螺旋区。碱基的性质是高阶结构的第二位，且只要它们保留二级结构，就可以进行取代。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有准螺旋结构。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有至少一个具有准螺旋结构的区段。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括富u或富a序列或其组合中的至少一个。在一些实施例中，富u和/或富a序列以将产生三联准螺旋结构的方式排列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有双准螺旋结构。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有一个或多个具有双准螺旋结构的区段(例如2、3、4、5、6或更多个)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括富c和/或富g的序列中的至少一个。在一些实施例中，富c和/或富g序列以将产生三联准螺旋结构的方式排列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有有助于稳定的分子内三联准螺旋结构。[0661]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有两个准螺旋结构(例如，通过磷酸二酯键隔开)，使得它们末端的碱基对堆叠，并且准螺旋结构变为共线性，导致“同轴堆叠”的子结构。[0662]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括具有一个或多个基序的三级结构，例如假结、g-四链体、螺旋和同轴堆叠。[0663]在国际专利公开号wo2019/118919的段落[0326]-[0333]中描述了如本文所披露的环状多核糖核苷酸的结构的其他实例，该专利特此通过援引以其全文并入。[0664]作为其环化的结果，环状多核糖核苷酸可能包括某些使其区别于线性rna的特征。例如，与线性rna相比，环状多核糖核苷酸不易被核酸外切酶降解。这样，环状多核糖核苷酸可以比线性rna更稳定，尤其是在核酸外切酶存在下孵育时。与线性rna相比，环状多核糖核苷酸的稳定性提高，可使环状多核糖核苷酸作为产生多肽(例如，免疫原和/或佐剂)的细胞转化试剂更加有用。与线性rna相比，环状多核糖核苷酸的稳定性提高，可使环状多核糖核苷酸与线性rna相比，更易储存更长时间。可以使用本领域标准的方法测试用核酸外切酶处理的环状多核糖核苷酸的稳定性，该方法确定是否已经发生rna降解(例如，通过凝胶电泳)。[0665]此外，与线性rna不同，当环状多核糖核苷酸与磷酸酶诸如小牛肠磷酸酶一起孵育时，环状多核糖核苷酸可能不太容易去磷酸化。[0666]在一些实施例中，本文提供的环状多核糖核苷酸制剂具有比参考物，例如具有相同核苷酸序列但未环化的线性多核糖核苷酸(例如，线性对应物)增加的半衰期。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸对例如核酸外切酶的降解有抗性。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸抗自降解。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少酶促裂解位点，例如dicer裂解位点。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有的半衰期长于参考物(例如线性对应物)至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、至少约180％、至少约200％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％、至少约1000％或至少约10000％。[0667]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在细胞分裂期间持续存在于细胞中。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在有丝分裂后持续存在于子细胞中。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在细胞内复制并传递给子细胞。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括介导环状多核糖核苷酸的自复制的复制元件。在一些实施例中，复制元件介导环状多核糖核苷酸转录成与环状多核糖核苷酸互补的线性多核糖核苷酸(线性互补)。在一些实施例中，线性互补的多核糖核苷酸可以在细胞中体内环化为互补的环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，互补的多核糖核苷酸可以进一步自复制成另一个环状多核糖核苷酸，该环状多核糖核苷酸具有与起始环状多核糖核苷酸相同或相似的核苷酸序列。一种示例性自复制元件包括hdv复制结构域(如beeharry等人,virol[病毒学],2014,450-451:165-173所述)。在一些实施例中，细胞以至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％的效率将至少一种环状多核糖核苷酸传递至子细胞。在一些实施例中，正经历减数分裂的细胞以至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％的效率将环状多核糖核苷酸传递至子细胞。在一些实施例中，正经历有丝分裂的细胞以至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％的效率将环状多核糖核苷酸传递至子细胞。[0668]在国际专利公开号wo2019/118919的段落[0308]-[0309]中描述了如本文所披露的环状多核糖核苷酸的稳定性和半衰期的其他实例，该专利特此通过援引以其全文并入。[0669]修饰[0670]相对于参考序列(尤其是亲本多核糖核苷酸)，环状多核糖核苷酸可以包括本披露范围内包括的一个或多个取代、插入和/或添加、缺失和共价修饰。[0671]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个转录后修饰(例如，加帽、裂解、聚腺苷酸化、剪接、聚a序列、甲基化、酰化、磷酸化、赖氨酸和精氨酸残基的甲基化、乙酰化、以及硫醇基团和酪氨酸残基的亚硝基化等)。该一个或多个转录后修饰可以是任何转录后修饰，诸如已经在rna中鉴定出的多于一百种不同的核苷修饰中的任一种(rozenski,j,crain,p和mccloskey,j.(1999).thernamodificationdatabase:1999update[rna修饰数据库:1999年更新].nuclacidsres[核酸研究]27:196-197)。在一些实施例中，第一分离核酸包括信使rna(mrna)。在一些实施例中，该mrna包括至少一个选自下组的核苷：诸如国际专利公开号wo2019/118919a1的[0311]中描述的那些，该专利公开通过援引以其全文并入本文。[0672]环状多核糖核苷酸可以包括任何有用的修饰，如针对糖、核碱基或核苷间键(例如对连接的磷酸酯/对磷酸二酯键/对磷酸二酯主链)。嘧啶核碱基的一个或多个原子可以被任选取代的氨基、任选取代的硫醇、任选取代的烷基(例如甲基或乙基)或卤代(例如氯代或氟代)替代或取代。在某些实施例中，在每个糖和核苷间键中存在修饰(例如，一个或多个修饰)。修饰可以是对脱氧核糖核酸(dna)、苏糖核酸(tna)、乙二醇核酸(gna)、肽核酸(pna)、锁核酸(lna)或其杂交体的核糖核酸(rna)修饰。本文描述了其他修饰。[0673]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括至少一种n(6)甲基腺苷(m6a)修饰以增加翻译效率。在一些实施例中，n(6)甲基腺苷(m6a)修饰可降低环状多核糖核苷酸的免疫原性(例如，降低免疫或炎性反应的一种或多种标志物的水平)。[0674]在一些实施例中，修饰可以包括化学或细胞诱导的修饰。例如，细胞内rna修饰的一些非限制性实例如lewis和pan,“rnamodificationsandstructurescooperatetoguiderna-proteininteractions[核糖核酸的修饰和结构共同引导核糖核酸和蛋白的相互作用]”,natreviewsmolcellbiol[自然评论：分子细胞生物学],2017,18:202-210所述。[0675]在一些实施例中，对环状多核糖核苷酸的核糖核苷酸的化学修饰可以增强免疫逃避。环状多核糖核苷酸可以通过本领域众所周知的方法合成和/或修饰，如在currentprotocolsinnucleicacidchemistry[核酸化学现行方案],beaucage,s.l等人(编辑),美国纽约州纽约约翰威利公司(johnwiley&sons,inc.,newyork,ny,usa)(通过援引以其全文特此并入本文)中描述的那些方法。修饰包括例如端部修饰，如5'端修饰(磷酸化(单、二和三磷酸化)、缀合、反向连接等)、3'端修饰(缀合、dna核苷酸、反向连接等)、碱基修饰(例如，用稳定的碱基、不稳定的碱基或与扩展的亲本库碱基配对的碱基替代)、碱基去除(脱碱基核苷酸)或碱基缀合。经修饰的核糖核苷酸碱基还可以包括5-甲基胞苷和假尿苷。在一些实施例中，举几个功能作用，碱基修饰可以调节环状多核糖核苷酸的表达、免疫反应、稳定性、亚细胞定位。在一些实施例中，修饰包括双正交核苷酸，例如非天然碱基。参见例如，kimoto等人,chemcommun(camb)[化学通讯(剑桥)],2017,53:12309,doi:10.1039/c7cc06661a，将该文献通过援引以其全文特此并入。[0676]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的一个或多个核糖核苷酸的糖修饰(例如在2'位置或4'位置)或糖替代以及主链修饰可以包括磷酸二酯键的修饰或替代。环状多核糖核苷酸的具体实例包括但不限于包括经修饰的主链或非天然核苷间键(如核苷间修饰，包括磷酸二酯键的修饰或替代)的环状多核糖核苷酸。具有经修饰的主链的环状多核糖核苷酸尤其包括在主链中不具有磷原子的那些。出于本技术的目的，并且如本领域中有时提及的，在其核苷间主链中不具有磷原子的经修饰的rna也可以被认为是寡核苷。在特定的实施例中，环状多核糖核苷酸将包括在其核苷间主链中具有磷原子的核糖核苷酸。[0677]经修饰的环状多核糖核苷酸主链可以包括，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(如3'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(如3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫羰基氨基磷酸酯(thionophosphoramidate)、硫羰烷基膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯、和具有正常3'-5'键的硼烷磷酸酯，这些的2'-5'连接的类似物，以及具有相反极性的那些，其中相邻的核苷单元对3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'连接。也包括各种盐、混合盐和游离酸形式。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以带负电荷或带正电荷。[0678]可掺入环状多核糖核苷酸中的经修饰的核苷酸可在核苷间键(例如磷酸酯主链)上被修饰。在此，在多核苷酸主链的上下文中，短语“磷酸酯”和“磷酸二酯”可互换使用。可以通过用不同的取代基替代一个或多个氧原子来修饰主链磷酸酯基团。此外，经修饰的核苷和核苷酸可以包括用如本文所述的另一个核苷间键合进行的对未修饰的磷酸酯部分的整体替代。经修饰的磷酸酯基团的实例包括但不限于硫代磷酸酯、亚磷酸硒酸酯、硼酸磷酸酯、硼酸磷酸酯、氢膦酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。二硫代磷酸酯的两个非连接氧都被硫替代。也可以通过用氮(桥连的氨基磷酸酯)、硫(桥连的硫代磷酸酯)和碳(桥连的亚甲基膦酸酯)替代连接氧来修饰磷酸酯接头。[0679]提供a-硫代取代的磷酸酯部分以通过非天然硫代磷酸酯主链键赋予rna和dna聚合物稳定性。硫代磷酸酯dna和rna具有增强的核酸酶抗性，并因此在细胞环境中具有更长的半衰期。与环状多核糖核苷酸连接的硫代磷酸酯有望通过减弱细胞先天免疫分子的结合/激活来降低先天免疫反应。[0680]在特定的实施例中，经修饰的核苷包括α-硫代-核苷(例如5'-o-(1-硫代磷酸)-腺苷、5'-o-(1-硫代磷酸)-胞苷(α-硫代胞苷)、5'-o-(1-硫代磷酸)-鸟苷、5'-o-(1-硫代磷酸)-尿苷或5'-o-(1-硫代磷酸)-假尿苷)。[0681]本文描述了可根据本披露使用的其他核苷间键，包括不包含磷原子的核苷间键。[0682]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括一种或多种细胞毒性核苷。例如，细胞毒性核苷可以被掺入环状多核糖核苷酸中，如双功能修饰。细胞毒性核苷可以包括但不限于阿糖腺苷、5-氮杂胞苷、4'-硫代阿糖胞苷、环戊烯基胞嘧啶、克拉屈滨、氯法拉滨、阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖胞苷、1-(2-c-氰基-2-脱氧-β-d-阿拉伯-戊呋喃糖基)-胞嘧啶、地西他滨、5-氟尿嘧啶、氟达拉滨、氟尿苷、吉西他滨、替加氟和尿嘧啶的组合、替加氟((rs)-5-氟-1-(四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1h,3h)-二酮)、曲沙他滨、替扎西他滨、2'-脱氧-2'-亚甲基胞苷(dmdc)和6-巯基嘌呤。其他实例包括氟达拉滨磷酸酯、n4-山嵛酰基-1-β-d-阿拉伯戊呋喃糖基胞嘧啶、n4-十八烷基-1-β-d-阿拉伯戊呋喃糖基胞嘧啶、n4-棕榈酰基-1-(2-c-氰基-2-脱氧-β-d-阿拉伯-戊呋喃糖基)胞嘧啶和p-4055(阿糖胞苷5'-花生酸酯)。[0683]环状多核糖核苷酸可以沿着分子的整个长度均一地修饰或可以不如此。例如，一种或多种或所有类型的核苷酸(例如，天然存在的核苷酸、嘌呤或嘧啶，或a、g、u、c、i、pu中的任一种或多种或全部)在环状多核糖核苷酸中，或在其给定的预定序列区域中可以被均一地修饰或可以不如此。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括假尿苷。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括肌苷，相对于病毒rna，肌苷可以帮助免疫系统将环状多核糖核苷酸表征为内源性。肌苷的掺入还可以介导改善rna稳定性/减少降解。参见例如yu,z等人,(2015)rnaeditingbyadar1marksdsrnaas“self”[通过adar1进行的rna编辑将dsrna标记为“自身”].cellres[细胞研究].25,1283-1284，其通过援引以其全文并入本文。[0684]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸(或其给定序列区域)中的所有核苷酸均被修饰。在一些实施例中，修饰可以包括可增强表达的m6a；可减弱免疫反应的肌苷；可增加rna稳定性或翻译通读(交错元件)的假尿苷；可增加稳定性的m5c；以及有助于亚细胞易位(例如，核定位)的2,2,7-三甲基鸟苷。[0685]在环状多核糖核苷酸的各个位置上可以存在不同的糖修饰、核苷酸修饰和/或核苷间键合(例如主链结构)。本领域普通技术人员将理解，核苷酸类似物或其他一个或多个修饰可以位于环状多核糖核苷酸的任何一个或多个位置，使得环状多核糖核苷酸的功能基本上不降低。修饰也可以是非编码区域修饰。环状多核糖核苷酸可以包含约1％至约100％的经修饰核苷酸(相对于总核苷酸含量，或相对于一种或多种类型的核苷酸，即a、g、u或c中的任一种或多种)或任何中间百分比(例如，1％至20％》、1％至25％、1％至50％、1％至60％、1％至70％、1％至80％、1％至90％、1％至95％、10％至20％、10％至25％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％到80％、10％至90％、10％至95％、10％至100％、20％至25％、20％至50％、20％至60％、20％至70％、20％至80％、20％至90％、20％至95％、20％至100％、50％至60％、50％至70％、50％至80％、50％至90％、50％至95％、50％至100％、70％至80％、70％至90％、70％至95％、70％至100％、80％至90％、80％至95％、80％至100％、90％至95％、90％至100％和95％至100％)。[0686]结构[0687]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括高阶结构，例如二级或三级结构。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的互补区段将其自身折叠成双链区段，与氢键结合配对(例如，a-u和c-g)。在一些实施例中，螺旋，也称为茎，在分子内形成，具有连接至端环的双链区段。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有至少一个具有准双链二级结构的区段。在一些实施例中，具有准双链二级结构的区段具有至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个配对的核苷酸。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有一个或多个具有准双链二级结构的区段(例如2、3、4、5、6或更多个)。在一些实施例中，区段被3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核苷酸隔开。[0688]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的一个或多个序列包括基本上单链的与双链的区域。在一些实施例中，单链与双链的比率可以影响环状多核糖核苷酸的功能。[0689]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的一个或多个序列基本上是单链的。在一些实施例中，基本上单链的环状多核糖核苷酸的一个或多个序列可以包括蛋白质或rna结合位点。在一些实施例中，基本上单链的环状多核糖核苷酸序列可以是构象柔性的以允许增加相互作用。在一些实施例中，有目的地将环状多核糖核苷酸的序列工程化以包括此类二级结构，从而结合或增加蛋白质或核酸结合。[0690]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有至少一个结合位点，例如，至少一个蛋白质结合位点、至少一个mirna结合位点、至少一个lncrna结合位点、至少一个trna结合位点、至少一个rrna结合位点、至少一个snrna结合位点、至少一个sirna结合位点、至少一个pirna结合位点、至少一个snorna结合位点、至少一个snrna结合位点、至少一个exrna结合位点、至少一个scarna结合位点、至少一个yrna结合位点、至少一个hnrna结合位点和/或至少一个trna基序。[0691]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸构造为包括高阶结构，诸如国际专利公开号wo2019/118919a1中描述的那些，该专利公开通过援引以其全文并入本文。[0692]生产方法[0693]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括非天然存在的脱氧核糖核酸序列，并且可以使用重组技术(例如，使用dna质粒体外衍生)或化学合成或其组合产生。[0694]在本披露的范围内，用于产生rna环的dna分子可以包括天然存在的原始核酸序列的dna序列、其修饰形式或编码通常未在自然中发现的合成多肽的dna序列(例如，嵌合分子或融合蛋白，诸如包括多种免疫原的融合蛋白)。dna和rna分子可以使用多种技术修饰，包括但不限于经典诱变技术和重组技术，如定点诱变、化学处理核酸分子以诱导突变、限制性酶裂解核酸片段、连接核酸片段、聚合酶链式反应(pcr)扩增和/或诱变核酸序列的选定区域、合成寡核苷酸混合物以及连接混合物基团以“建造”核酸分子混合物、及其组合。[0695]环状多核糖核苷酸可以根据任何可用的技术制备，这些技术包括但不限于化学合成和酶促合成。在一些实施例中，线性初级构建体或线性mrna可被环化或连环化以产生本文所述的环状多核糖核苷酸。环化或连环化的机制可以通过诸如但不限于化学、酶促、夹板连接或核酶催化的方法来发生。新形成的5'-/3'-键可以是分子内键或分子间键。[0696]制备本文所述的环状多核糖核苷酸的方法描述于以下中，例如，khudyakov&fields,artificialdna:methodsandapplications[人工dna：方法与应用],crcpress[crc出版社](2002)；zhao,syntheticbiology:toolsandapplications[合成生物学：工具与应用](第一版),academicpress[学术出版社](2013)；以及egli和herdewijn,chemistryandbiologyofartificialnucleicacids[人工核酸的化学与生物学],(第一版),wiley-vch[威利-vch出版社](2012)。[0697]多种合成环状多核糖核苷酸的方法也在本领域中进行了描述(参见例如，美国专利号us6210931、美国专利号us5773244、美国专利号us5766903、美国专利号us5712128、美国专利号us5426180、美国公开号us20100137407、国际公开号wo1992001813和国际公开号wo2010/084371；其各自的内容通过援引以其全文并入本文)。[0698]环化[0699]在一些实施例中，用于环化的线性多核糖核苷酸可以被环化或连环化。在一些实施例中，用于环化的线性多核糖核苷酸可以在配制和/或递送之前在体外环化。在一些实施例中，用于环化的线性多核糖核苷酸可以在细胞内环化。[0700]细胞外环化[0701]在一些实施例中，使用化学方法环化或连环化用于环化的线性多核糖核苷酸以形成环状多核糖核苷酸。在一些化学方法中，核酸(例如，用于环化的线性多核糖核苷酸)的5'-末端和3'-末端包括化学反应性基团，当基团彼此靠近时，可在分子的3'-末端和5'-末端之间形成新的共价键。5'-端可以含有nhs酯反应性基团，且3'-端可以含有3'-氨基末端的核苷酸，使得在有机溶剂中，线性rna分子3'-端上的3'-氨基末端的核苷酸将在5'-nhs-酯部分上经历亲核攻击，形成新的5'-/3'-酰胺键。[0702]在一些实施例中，使用dna或rna连接酶将5'-磷酸化的核酸分子(例如，用于环化的线性多核糖核苷酸)酶促连接至核酸(例如，线性核酸)的3'-羟基，形成新的磷酸二酯键。在示例性反应中，根据制造商的方案，将用于环化的线性多核糖核苷酸与1-10单位的t4rna连接酶(新英格兰生物学实验室公司(newenglandbiolabs)，马萨诸塞州伊普斯威奇(ipswich,ma))在37℃下孵育1小时。连接反应可以在存在线性核酸时发生，该线性核酸能够与并列的5'-和3'-区域碱基配对，以辅助酶促连接反应。在一些实施例中，连接是夹板连接。例如，夹板连接酶，如连接酶，可用于夹板连接。对于夹板连接，单链多核苷酸(夹板)，如单链rna，可以被设计成与线性多核糖核苷酸的两个末端杂交，使得在与单链夹板杂交时可以将两个末端并列。因此，夹板连接酶可以催化线性多核糖核苷酸并列的两个末端的连接，生成环状多核糖核苷酸。[0703]在一些实施例中，dna或rna连接酶用于环状多核苷酸的合成。在一些实施例中，用于环化的线性多核糖核苷酸的5'-末端或3'-末端可编码连接酶核酶序列，使得在体外转录期间，所得用于环化的线性多核糖核苷酸包括活性核酶序列，该活性核酶序列能够连接用于环化的线性多核糖核苷酸的5'-末端至用于环化的线性多核糖核苷酸的3'-末端。连接酶核酶可以衍生自第i组内含子、丁型肝炎病毒、发夹核酶，或者可以通过selex(通过指数富集进行的配体系统进化)进行选择。核酶连接酶反应在0℃与37℃之间的温度下可能需要1小时至24小时。[0704]在一些实施例中，可通过使用至少一个非核酸部分将用于环化的线性多核糖核苷酸环化或连环化。在一方面，该至少一个非核酸部分可与用于环化的线性多核糖核苷酸的5'端附近和/或3'端附近的区域或特征反应，以环化或连环化用于环化的线性多核糖核苷酸。在另一方面，该至少一个非核酸部分可以位于或连接至或邻近用于环化的线性多核糖核苷酸的5'端和/或3'端。设想的非核酸部分可以是同源或异源的。作为一个非限制性实例，非核酸部分可以是键，如疏水键、离子键、可生物降解的键和/或可裂解的键。作为另一个非限制性实例，非核酸部分是连接部分。作为又一个非限制性实例，非核酸部分可以是寡核苷酸或肽部分，诸如，如本文所述的适体或非核酸接头。[0705]在一些实施例中，用于环化的线性多核糖核苷酸由于非核酸部分而被环化或连环化，造成位于、邻近或连接至用于环化的线性多核糖核苷酸的5’末端和3'末端的原子、分子表面之间的吸引。作为一个非限制性实例，可通过分子间作用力或分子内作用力将一个或多个用于环化的线性多核糖核苷酸环化或连环化。分子间作用力的非限制性实例包括偶极-偶极力、偶极诱导偶极力、诱导偶极-诱导偶极力、范德华力和伦敦色散力。分子内作用力的非限制性实例包括共价键、金属键、离子键、共振键、抓氢键(agnosticbond)、偶极键、缀合、超缀合和反向键。[0706]在一些实施例中，用于环化的线性多核糖核苷酸可在5'端附近和3'端附近包含核酶rna序列。当序列暴露于核酶的其余部分时，核酶rna序列可以共价地连接至肽。在一方面，共价连接至5'端和3'端附近的核酶rna序列的肽可以彼此缔合，引起用于环化的线性多核糖核苷酸环化或连环化。在另一方面，肽共价地连接至核酶rna序列5'末端和3'末端附近可以引起线性初级构建体或线性mrna在使用本领域已知的方法(诸如但不限于蛋白连接)进行连接后环化或连环化。用于本披露的线性初级构建体或线性rna中的核酶的非限制性实例，或掺入和/或共价连接肽的方法的非穷举列表在美国专利申请号us20030082768中描述，该专利内容通过援引以其全文并入本文。[0707]在一些实施例中，用于环化的线性多核糖核苷酸可以包括核酸的5'三磷酸，例如通过使5'三磷酸与rna5'焦磷酸水解酶(rpph)或atp二磷酸水解酶(脱磷酸酶)接触使其转化为5'单磷酸。替代性地，将用于环化的线性多核糖核苷酸的5'三磷酸转化为5'单磷酸可通过两步反应完成，该两步反应包括：(a)使用于环化的线性多核糖核苷酸的5'核苷酸与磷酸酶(例如，热敏磷酸酶、虾碱性磷酸酶或小牛肠磷酸酶)接触以除去所有三个磷酸；以及(b)在步骤(a)之后，使5'核苷酸与添加单个磷酸酯的激酶(例如，多核苷酸激酶)接触。[0708]在一些实施例中，本文提供的环化方法的环化效率为至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或100％。在一些实施例中，本文提供的环化方法的环化效率为至少约40％。在一些实施例中，所提供的环化方法的环化效率介于约10％至约100％之间；例如，环化效率可为约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％和约99％。在一些实施例中，环化效率介于约20％至约80％之间。在一些实施例中，环化效率介于约30％至约60％之间。在一些实施例中，环化效率为约40％。[0709]剪接元件[0710]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括至少一个剪接元件。在国际专利公开号wo2019/118919的段落[0270]-[0275]中描述了示例性剪接元件，该专利公开特此通过援引以其全文并入。[0711]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括至少一个剪接元件。在本文提供的环状多核糖核苷酸中，剪接元件可以是可以介导环状多核糖核苷酸的剪接的完整剪接元件。替代性地，剪接元件也可以是来自完成的剪接事件的剩余剪接元件。例如，在一些情况下，线性多核糖核苷酸的剪接元件可介导导致线性多核糖核苷酸环化的剪接事件，从而所得的环状多核糖核苷酸包含来自此类剪接介导的环化事件的剩余剪接元件。在一些情况下，剩余剪接元件无法介导任何剪接。在其他情况下，剩余剪接元件在某些情况下仍可以介导剪接。在一些实施例中，剪接元件与至少一个表达序列相邻。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与每个表达序列相邻的剪接元件。在一些实施例中，剪接元件在每个表达序列的一侧或两侧，导致例如一种或多种肽和/或一种或多种多肽的表达产物的隔开。[0712]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括内部剪接元件，该剪接元件在被复制时，剪接端部被连接在一起。一些实例可以包括具有剪接位点序列和短反向重复序列(30-40nt)的微型内含子(《100nt)，如alusq2、alujr和alusz、侧接内含子中的反向序列、侧接内含子中的alu元件以及在接近反向剪接事件的(suptable4富集基序)顺式序列元件中发现的基序，如带有侧接外显子的反向剪接位点(backsplicesite)之前(上游)或之后(下游)200bp中的序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括至少一个本文其他处所述的重复核苷酸序列作为内部剪接元件。在此类实施例中，重复核苷酸序列可以包括来自alu家族内含子的重复序列。在一些实施例中，剪接相关的核糖体结合蛋白可以调控环状多核糖核苷酸的生物发生(例如，盲肌蛋白和震动蛋白(qki)剪接因子)。[0713]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括侧接环状多核糖核苷酸的头尾接合点处的典范剪接位点。[0714]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括隆起-螺旋-隆起基序，包含两个3-核苷酸隆起侧接的4-碱基对茎。裂解发生在隆起区域的一个位点处，生成末端为5'-羟基和2',3'-环状磷酸酯的特征片段。通过将5'-oh基团亲核攻击到形成3',5'-磷酸二酯桥的同一分子的2',3'-环状磷酸酯上来进行环化。[0715]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括具有hpr元件的多聚重复rna序列。hpr包括2′,3′‑环状磷酸酯和5′‑oh末端。hpr元件自加工用于环化的线性多核糖核苷酸的5'-末端和3'-末端，从而将这些末端连接在一起。[0716]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括自剪接元件。例如，环状多核糖核苷酸可以包括来自蓝细菌鱼腥藻(anabaena)的内含子。[0717]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括介导自连接的序列。在一个实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括hdv序列(例如，hdv复制结构域保守序列，ggcucaucucgacaagaggcggcaguccucaguacucuuacucuuuucuguaaagaggagacugcuggacucgccgcccaaguucgagcaugagcc(seqidno:5)或ggcuagaggcggcaguccucaguacucuuacucuuuucuguaaagaggagacugcuggacucgccgcccgagcc(seqidno:6)，以进行自连接。在一个实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括环e序列(例如在pstvd中)以进行自连接。在另一个实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括自环化内含子，例如5'和3'剪接接合，或自环化催化内含子，如i型、ii型或iii型内含子。i型内含子自剪接序列的非限制性实例可以包括源自t4噬菌体基因td的自剪接置换内含子-外显子序列和四膜虫的插入序列(ivs)rrna。[0718]其他环化方法[0719]在一些实施例中，用于环化的线性多核糖核苷酸可以包括互补序列，包括个体内含子内或侧接内含子内的重复或非重复核酸序列。重复核酸序列是在环状多核糖核苷酸的区段内出现的序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括重复核酸序列。在一些实施例中，重复核苷酸序列包括聚ca序列或聚ug序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与环状多核糖核苷酸的另一区段中的互补重复核酸序列杂交的至少一个重复核酸序列，其杂交的区段形成内部双链。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与环状多核糖核苷酸的另一区段中的互补重复核酸序列杂交的1至10个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9和10个)重复核酸序列，其杂交的区段形成内部双链。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与环状多核糖核苷酸的另一区段中的互补重复核酸序列杂交的2个重复核酸序列，其杂交的区段形成内部双链。在一些实施例中，两个单独的环状多核糖核苷酸的重复核酸序列和互补重复核酸序列杂交以生成单个环化多核糖核苷酸，杂交的区段形成内部双链。在一些实施例中，互补序列位于用于环化的线性多核糖核苷酸的5’末端和3'末端。在一些实施例中，互补序列包括约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个配对的核苷酸。[0720]在一些实施例中，环化化学方法可用于生成环状多核糖核苷酸。此类方法可以包括但不限于点击化学(例如，基于炔烃和叠氮化物的方法，或可点击的碱基)、烯烃复分解、氨基磷酸酯连接、半缩醛胺-亚胺交联、碱基修饰、及其任何组合。[0721]在一些实施例中，环化酶促方法可用于生成环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，连接酶，例如dna或rna连接酶，可用于生成环状多核糖核苷酸或互补物的模板、环状多核糖核苷酸的互补链或环状多核糖核苷酸。[0722]环状多核糖核苷酸的环化可以通过本领域已知的方法完成，例如，petkovic和muller,"rnacircularizationstrategiesinvivoandinvitro[体内外rna环化策略]"nucleicacidsres[核酸研究],2015,43(4):2454-2465，以及muller和appel,"invitrocircularizationofrna[rna的体外环化]"rnabiol[rna生物学],2017,14(8):1018-1027中描述的那些方法。[0723]环状多核糖核苷酸可编码可用于复制的序列和/或基序。在国际专利公开号wo2019/118919的段落[0280]-[0286]中描述了示例性复制元件，该专利公开特此通过援引以其全文并入。[0724]环状多核糖核苷酸的纯化[0725]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸是纯化的，例如，去除了游离核糖核酸、线性或带切口的rna、dna、蛋白质等。在一些实施例中，可以通过本领域通常使用的任何已知方法纯化环状多核糖核苷酸。纯化方法的非限制性实例包括柱色谱法、凝胶切除、尺寸排阻等。[0726]线性和环状rna的检测[0727]药物环状rna制剂中线性rna的存在可能具有意想不到的且有时不期望的影响。因此，可以相对于线性rna富集、分离和/或纯化环状rna；可以监测、评价和/或控制线性rna的方法(例如，制造环状rna制剂的方法)；以及使用此类药物组合物和制剂例如将效应子，诸如治疗性效应子或支架(例如，适体序列)递送至细胞、组织或受试者的方法。在一些实施例中，环状rna制剂具有不超过阈值水平的线性rna，例如环状rna制剂相对于线性rna经富集或经纯化以减少线性rna。[0728]通常，药物制剂中元素的检测和定量包括使用参考标准品，该参考标准品是目的组分(例如，环状rna、线性rna、片段、杂质等)或是类似材料(例如，使用与环状rna结构相同序列的线性rna结构作为环状rna的标准品)；或包括使用内标或来自测试样品的信号。在一些实施例中，标准品用于建立检测器对已知或相对量的材料的响应(响应因子)。在一些实施例中，响应因子是从一个或多个浓度的标准品确定的(例如，使用线性回归分析)。在一些实施例中，然后使用响应因子来从由于目的材料引起的信号确定该组分量。在一些实施例中，响应因子是值1或假设具有值1。[0729]在一些实施例中，使用与环状多核糖核苷酸的线性形式的比较来确定药物组合物中线性相对于环状rna的检测和定量。在一些实施例中，药物组合物中总核糖核苷酸的质量使用标准曲线确定，该标准曲线使用环状多核糖核苷酸的线性形式并且假设响应因子为1而生成。在一些实施例中，药物制剂中环状多核糖核苷酸的w/w百分比通过以下方式来确定：将通过多种已知量的环状多核糖核苷酸的线性形式的条带强度生成的标准曲线与药物制剂中环状多核糖核苷酸的条带强度进行比较。在一些实施例中，条带在基于凝胶的电泳期间产生，并且条带强度通过凝胶成像仪(例如，e-凝胶成像仪)来测量。在一些实施例中，当如本文所述评价时，环状多核糖核苷酸制剂包含小于阈值量(例如，其中阈值量是参考标准，例如关于环状多核糖核苷酸制剂的药物放行规格)的线性多核糖核苷酸分子。[0730]在一些实施例中，药物组合物中带切口rna相对于总rna的检测和定量通过在凝胶提取包含环状rna的制剂之后测序来确定。在一些实施例中，药物组合物中带切口rna相对于线性rna的检测和定量通过在凝胶提取包含环状rna的制剂之后测序来确定。在一些实施例中，当如本文所述评价时，环状多核糖核苷酸制剂包含小于阈值量(例如，其中阈值量是参考标准，例如关于环状多核糖核苷酸制剂的药物放行规格)的带切口rna、线性rna或组合的线性和带切口rna。例如，关于制剂中存在的线性多核糖核苷酸分子的量的参考标准是相对于制剂中的总核糖核苷酸分子不超过30％、20％、15％、10％、1％、0.5％或0.1％、或其间的任何百分比的线性多核糖核苷酸分子。在一些实施例中，关于制剂中存在的带切口多核糖核苷酸分子的量的参考标准是相对于制剂中的总核糖核苷酸分子不超过30％、20％、15％、10％、1％、0.5％或0.1％、或其间的任何百分比的带切口多核糖核苷酸分子。在一些实施例中，关于制剂中存在的线性和带切口多核糖核苷酸分子的量的参考标准是相对于制剂中的总核糖核苷酸分子不超过40％、30％、20％、15％、10％、1％、0.5％或0.1％、或其间的任何百分比的组合的线性多核糖核苷酸分子和带切口多核糖核苷酸分子。[0731]在一些实施例中，将标准品在与样品相同的条件下运行。例如，使用与样品相同类型的凝胶、相同的缓冲液和相同的暴露来运行标准品。在进一步的实施例中，将标准品与样品平行运行。在一些实施例中，在来自主题制剂的多个样品中重复(例如，两次或一式三份)对元素的定量以获得平均结果。在一些实施例中，对线性rna的定量使用平行毛细管电泳(例如，使用具有uv检测的片段分析仪或分析型hplc)测量。[0732]纯化方法[0733]可以从不需要的物质(诸如不需要的(例如，线性)rna、酶、dna)中分离、富集或纯化环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，不需要的物质存在于、或源自制备和/或制造环状多核糖核苷酸的工艺中。可以在配制为药物制剂、药物组合物、药物原料药、或药物成品药之前富集和/或纯化本文所述的环状多核糖核苷酸。可以在配制为药物制剂、药物组合物、药物原料药、或药物成品药期间或之后富集和/或纯化本文所述的环状多核糖核苷酸。[0734]在一些实施例中，可以在生产期间或之后纯化环状多核糖核苷酸，以去除不期望的元素，例如线性rna或带切口rna，以及公认的杂质，例如游离核糖核酸(例如，单核糖核酸、二核糖核酸、或三核糖核酸)、dna(例如，细胞dna，诸如宿主细胞dna)、细胞或工艺相关蛋白质杂质(例如，细胞或工艺相关杂质)等。在一些实施例中，杂质是工艺相关杂质。在一些实施例中，工艺相关杂质是蛋白质(例如，细胞蛋白质)、核酸(例如，细胞核酸)、缓冲液或缓冲试剂、酶、培养基/试剂组分(例如，培养基、培养基添加剂、过渡金属、或维生素)、制备性或分析性凝胶组分(例如，丙烯酰胺碎片)、dna、或色谱材料。缓冲试剂可以是mgcl2、dtt、atp、sds、na、糖原、tris-hcl、或etoh。缓冲试剂可以包括但不限于乙酸盐、tris、碳酸氢盐、磷酸盐、柠檬酸、乳酸盐、或tea。酶可以是连接酶。连接酶可以是t4rna连接酶2。在一些实施例中，杂质是缓冲试剂、培养基/试剂组分、盐、连接酶、核酸酶、rna酶抑制剂、rna酶r、线性多核糖核苷酸分子、脱氧核糖核苷酸分子、丙烯酰胺碎片、或单核苷酸分子。[0735]在一些实施例中，可以通过本领域中常用的任何已知方法富集或纯化环状多核糖核苷酸。非限制性纯化方法的实例包括柱色谱法、凝胶切除、尺寸排阻等。[0736]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸通过凝胶纯化。例如，可以在变性page上解析环状rna，并且可以切除对应于环状rna的条带，并且可以使用已知方法从条带中洗脱环状rna。然后可以分析洗脱的环状rna。[0737]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸通过色谱法纯化，该色谱法例如疏水相互作用色谱法(hic)、混合模式色谱法、液相色谱法(例如，反相离子对色谱法(ip-rp))、离子交换色谱法(ie)、亲和色谱法(ac)和尺寸排阻色谱法(sec)、及其任何组合。[0738]在一些实施例中，通过利用环状多核糖核苷酸的结构特征将其与线性rna或杂质分离来纯化环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，通过利用结构特征(例如，缺少游离端)来纯化环状多核糖核苷酸。例如，利用线性rna对应物或其片段的聚腺苷酸化，从包含含有相同核苷酸序列的环状rna和线性rna对应物的混合池的制剂中富集环状rna。可以使用聚(a)聚合酶将线性rna对应物或其片段的3'端聚腺苷酸化，从而导致3'聚腺嘌呤尾的添加。在一些实施例中，3'聚腺嘌呤尾使得能够使用柱(诸如亲和柱)下拉线性rna及其片段，以富集环状rna。聚(a)聚合酶还可以掺入修饰的腺嘌呤，诸如生物素化n6-atp类似物。将生物素化n6-atp类似物向3'聚腺嘌呤尾中的这种添加使得能够在系统(诸如生物素-链霉亲和素结合系统)中下拉线性rna及其片段。相比之下，环化rna没有3'端，并且因此不被聚(a)聚合酶聚腺苷酸化、没有用于缀合的聚腺苷酸尾、且不被在下拉中捕获。因此，在下拉后的制剂中富集了环状rna。[0739]在一些实施例中，通过利用线性rna的结构特征(例如，游离端的存在)来纯化环状多核糖核苷酸。例如，利用线性rna对应物的聚腺苷酸化，从包含含有相同核苷酸序列的环状rna和线性rna对应物的混合池的制剂中富集环状rna。可以将核酸外切酶添加至混合池中以水解线性rna。在一些实施例中，核酸外切酶可以是3'核酸外切酶或5'核酸外切酶。在一些实施例中，可以使用3'核酸外切酶和5'核酸外切酶。[0740]在一个实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)是基于质量至少25％(w/w)、30％(w/w)、40％(w/w)、50％(w/w)、60％(w/w)、70％(w/w)、80％(w/w)、85％(w/w)、90％(w/w)、91％(w/w)、92％(w/w)、93％(w/w)、94％(w/w)、95％(w/w)、96％(w/w)、97％(w/w)、98％(w/w)、99％(w/w)、或100％(w/w)纯的。纯度可以通过本领域技术人员已知的多种分析技术中的任一种来测量，这些分析技术诸如但不限于使用分离技术，诸如色谱法(使用柱、使用纸、使用凝胶、使用hplc、使用uhplc等，或通过ic、通过sec、通过反相、通过阴离子交换、通过混合模式等)或使用或不使用分离前或分离后衍生化方法的电泳(尿素page、基于芯片的、聚丙烯酰胺凝胶、rna、毛细管、c-ief等)，使用基于质谱法、uv-vis、荧光、光散射、折射率，或利用银或染料染色或放射性衰变用于检测的检测技术。替代性地，纯度可以在不使用分离技术的情况下通过质谱法、显微镜法、圆二色性(cd)光谱法、uv或uv-vis分光光度法、荧光法(例如，qubit)、rna酶h分析、表面等离子体共振(spr)、或利用银或染料染色或放射性衰变用于检测的方法。[0741]在一些实施例中，可以通过生物学测试方法(例如，基于细胞的或基于受体的测试)来测量纯度。在一些实施例中，本文所述的制剂中总质量核糖核苷酸的至少25％(w/w)、30％(w/w)、40％(w/w)、50％(w/w)、60％(w/w)、70％(w/w)、80％(w/w)、85％(w/w)、90％(w/w)、91％(w/w)、92％(w/w)、93％(w/w)、94％(w/w)、95％(w/w)、96％(w/w)、97％(w/w)、98％(w/w)、99％(w/w)或100％(w/w)以环状多核糖核苷酸分子包含。该百分比可以通过本领域技术人员已知的多种分析技术中的任一种来测量，这些分析技术诸如但不限于使用分离技术，诸如色谱法(使用柱、使用纸、使用凝胶、使用hplc、使用uhplc等，或通过ic、通过sec、通过反相、通过阴离子交换、通过混合模式等)或使用或不使用分离前或分离后衍生化方法的电泳(尿素page、基于芯片的、聚丙烯酰胺凝胶、rna、毛细管、c-ief等)，使用基于质谱法、uv-vis、荧光、光散射、折射率，或利用银或染料染色或放射性衰变用于检测的检测技术。替代性地，纯度可以在不使用分离技术的情况下通过质谱法、显微镜法、圆二色性(cd)光谱法、uv或uv-vis分光光度法、荧光法(例如，qubit)、rna酶h分析、表面等离子体共振(spr)、或利用银或染料染色或放射性衰变用于检测的方法。[0742]在一个实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有至少0.1ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml、5000μg/ml、10,000μg/ml、100,000μg/ml、200mg/ml、300mg/ml、400mg/ml、500mg/ml、600mg/ml、650mg/ml、700mg/ml、或750mg/ml的环状多核糖核苷酸浓度。在一个实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)基本上不含单核苷酸或具有不超过1pg/ml、10pg/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、1000μg/ml、5000μg/ml、10,000μg/ml、或100,000μg/ml的单核苷酸含量。在一个实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有从检测限至1pg/ml、10pg/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、1000μg/ml、5000μg/ml、10,000μg/ml、或100,000μg/ml的单核苷酸含量。[0743]在一个实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有基于质量占总核苷酸不超过0.1％(w/w)、0.2％(w/w)、0.3％(w/w)、0.4％(w/w)、0.5％(w/w)、0.6％(w/w)、0.7％(w/w)、0.8％(w/w)、0.9％(w/w)、1％(w/w)、2％(w/w)、3％(w/w)、4％(w/w)、5％(w/w)、6％(w/w)、7％(w/w)、8％(w/w)、9％(w/w)、10％(w/w)、15％(w/w)、20％(w/w)、25％(w/w)、30％(w/w)、或其间的任何百分比的单核苷酸含量，其中总核苷酸含量是脱氧核糖核苷酸分子和核糖核苷酸分子的总质量。[0744]在一个实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有不超过1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、600ng/ml、1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200g/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml、900μg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml、300mg/ml、400mg/ml、500mg/ml、600mg/ml、650mg/ml、700mg/ml、或750mg/ml的线性rna含量，例如线性rna对应物或rna片段。在一个实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有从检测限至1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、600ng/ml、1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200g/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml、900μg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml、300mg/ml、400mg/ml、500mg/ml、600mg/ml、650mg/ml、700mg/ml、或750mg/ml的线性rna含量，例如线性rna对应物或rna片段。[0745]在一个实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有不超过10％(w/w)、9.9％(w/w)、9.8％(w/w)、9.7％(w/w)、9.6％(w/w)、9.5％(w/w)、9.4％(w/w)、9.3％(w/w)、9.2％(w/w)、9.1％(w/w)、9％(w/w)、8％(w/w)、7％(w/w)、6％(w/w)、5％(w/w)、4％(w/w)、3％(w/w)、2％(w/w)、1％(w/w)、0.5％(w/w)、或0.1％(w/w)、或其间的百分比的带切口rna含量。在一个实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有低至零的带切口rna含量或基本上不含带切口rna。[0746]在一个实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有不超过70％(w/w)、60％(w/w)、50％(w/w)、40％(w/w)、30％(w/w)、25％(w/w)、20％(w/w)、15％(w/w)、10％(w/w)、9％(w/w)、8％(w/w)、7％(w/w)、6％(w/w)、5％(w/w)、4％(w/w)、3％(w/w)、2％(w/w)、1％(w/w)、0.5％(w/w)、或0.1％(w/w)、或其间的百分比的组合的线性rna和带切口的rna含量。在一个实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有低至零的组合的带切口rna和线性rna含量或基本上不含带切口和线性rna。[0747]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有不超过分析方法的检测限的线性rna含量，例如线性rna对应物或rna片段，这些分析方法诸如利用以下项的方法：质谱法、uv光谱或荧光检测器、光散射技术、使用或不使用分离方法包括hplc的表面等离子体共振(spr)、通过hplc、使用或不使用分离前或分离后衍生化方法的基于芯片或凝胶的电泳、使用银或染料染色或放射性衰变的检测方法、或显微镜、目测法或分光光度计。[0748]在一个实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有例如如通过实例2中的方法测量的不超过0.1％(w/w)、1％(w/w)、2％(w/w)、3％(w/w)、4％(w/w)、5％(w/w)、6％(w/w)、7％(w/w)、8％(w/w)、9％(w/w)、10％(w/w)、15％(w/w)、20％(w/w)、25％(w/w)、30％(w/w)、35％(w/w)、40％(w/w)、45％(w/w)、50％(w/w)的线性rna。[0749]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸制剂的线性多核糖核苷酸分子包括环状多核糖核苷酸分子的线性对应物或其片段。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸制剂的线性多核糖核苷酸分子包括线性对应物(例如，环化前形式)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸制剂的线性多核糖核苷酸分子包括环状多核糖核苷酸的非对应物或其片段。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸制剂的线性多核糖核苷酸分子包括环状多核糖核苷酸的非对应物。在一些实施例中，线性多核糖核苷酸分子包括环状多核糖核苷酸的对应物和环状多核糖核苷酸的非对应物或其片段的组合。在一些实施例中，线性多核糖核苷酸分子包括环状多核糖核苷酸的对应物和环状多核糖核苷酸的非对应物的组合。在一些实施例中，线性多核糖核苷酸分子片段是长度为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000个、或更多个核苷酸、或其间的任何核苷酸数的片段。[0750]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有例如如通过分光光度计测量的从约1.6至约2.3的a260/a280吸光度比。在一些实施例中，a260/a280吸光度比是约1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、或其间的任何数。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸生产中的中间体)具有例如如通过分光光度计测量的大于约1.8的a260/a280吸光度比。在一些实施例中，a260/a280吸光度比是约1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、或更大。[0751]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)基本上不含杂质。在各种实施例中，包含环状多核糖核苷酸的组合物中至少一种杂质的水平与在去除杂质的纯化或处理之前组合物的该水平相比降低至少30％(w/w)、至少40％(w/w)、至少50％(w/w)、至少60％(w/w)、至少70％(w/w)、至少80％(w/w)、至少90％(w/w)、或至少95％(w/w)。在一些实施例中，至少一种工艺相关杂质的水平与在去除杂质的纯化或处理之前组合物的该水平相比降低至少30％(w/w)、至少40％(w/w)、至少50％(w/w)、至少60％(w/w)、至少70％(w/w)、至少80％(w/w)、至少90％(w/w)、或至少95％(w/w)。在一些实施例中，至少一种产品相关物质的水平与在去除杂质的纯化或处理之前组合物的该水平相比降低至少30％(w/w)、至少40％(w/w)、至少50％(w/w)、至少60％(w/w)、至少70％(w/w)、至少80％(w/w)、至少90％(w/w)、或至少95％(w/w)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)进一步基本上不含工艺相关杂质。在一些实施例中，工艺相关杂质包括蛋白质(例如，细胞蛋白质，诸如宿主细胞蛋白质)、脱氧核糖核酸(例如，细胞脱氧核糖核酸，诸如宿主细胞脱氧核糖核酸)、单脱氧核糖核苷酸或双脱氧核糖核苷酸分子、酶(例如，核酸酶(诸如核酸内切酶或核酸外切酶)、或连接酶)、试剂组分、凝胶组分、或色谱材料。在一些实施例中，该杂质选自：缓冲试剂、连接酶、核酸酶、rna酶抑制剂、rna酶r、脱氧核糖核苷酸分子、丙烯酰胺凝胶碎片、和单脱氧核糖核苷酸分子。在一些实施例中，药物制剂包含少于0.1ng、1ng、5ng、10ng、15ng、20ng、25ng、30ng、35ng、40ng、50ng、60ng、70ng、80ng、90ng、100ng、200ng、300ng、400ng、或500ng蛋白质污染物/毫克(mg)环状多核糖核苷酸分子的蛋白质(例如，细胞蛋白质，诸如宿主细胞蛋白质)污染物。[0752]在一个实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)基本上不含dna含量，例如模板dna或细胞dna(例如，宿主细胞dna)，或具有低至零的dna含量，或具有不超过1pg/ml、10pg/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、1000μg/ml、5000μg/ml、10,000μg/ml、或100,000μg/ml的dna含量。[0753]在一个实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)基本上不含dna含量，具有低至零的dna含量，或具有基于质量占总核苷酸不超过0.001％(w/w)、0.01％(w/w)、0.1％(w/w)、1％(w/w)、2％(w/w)、3％(w/w)、4％(w/w)、5％(w/w)、6％(w/w)、7％(w/w)、8％(w/w)、9％(w/w)、10％(w/w)、15％(w/w)、20％(w/w)、25％(w/w)、30％(w/w)、35％(w/w)、40％(w/w)、45％(w/w)、50％(w/w)的dna含量，其中总核苷酸分子是脱氧核糖核苷酸含量和核糖核苷酸分子的总质量。在一个实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)基本上不含dna含量，具有低至零的dna含量，或具有基于质量占总核苷酸不超过0.001％(w/w)、0.01％(w/w)、0.1％(w/w)、1％(w/w)、2％(w/w)、3％(w/w)、4％(w/w)、5％(w/w)、6％(w/w)、7％(w/w)、8％(w/w)、9％(w/w)、10％(w/w)、15％(w/w)、20％(w/w)、25％(w/w)、30％(w/w)、35％(w/w)、40％(w/w)、45％(w/w)、50％(w/w)的dna含量，如在通过消化核苷的酶进行总dna消化后通过定量液体色谱法-质谱法(lc-ms)测量的，其中dna的含量从如通过lc-ms测量的每种碱基(即，a、c、g、t)的标准曲线反演计算出。[0754]在一个实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有不超过0.1ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、或500ng/ml的蛋白质(例如，细胞蛋白质(cp)(例如，酶)、生产相关蛋白(例如，载体蛋白))污染物。在一个实施例中，环状多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸生产中的中间体)具有从检测限至0.1ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、或500ng/ml的蛋白质(例如，生产相关蛋白诸如细胞蛋白质(cp)，例如酶)污染物。[0755]在一个实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有少于0.1ng、1ng、5ng、10ng、15ng、20ng、25ng、30ng、35ng、40ng、50ng、60ng、70ng、80ng、90ng、100ng、200ng、300ng、400ng、或500ng/毫克(mg)环状多核糖核苷酸的蛋白质(例如，生产相关蛋白诸如细胞蛋白质(cp)，例如酶)污染物。在一个实施例中，环状多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸生产中的中间体)具有从检测水平至0.1ng、1ng、5ng、10ng、15ng、20ng、25ng、30ng、35ng、40ng、50ng、60ng、70ng、80ng、90ng、100ng、200ng、300ng、400ng、或500ng/毫克(mg)环状多核糖核苷酸的蛋白质(例如，生产相关蛋白诸如细胞蛋白质(cp)，例如酶)污染物。[0756]在一个实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有低水平的内毒素或基本上不存在内毒素，例如如通过鲎变形细胞裂解物(lal)测试测量的。在一些实施例中，药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸生产中的中间体如通过鲎变形细胞裂解物测试所测量包含少于20eu/kg(重量)、10eu/kg、5eu/kg、1eu/kg的内毒素，或缺少内毒素。在一个实施例中，环状多核糖核苷酸组合物具有低水平或不存在的核酸酶或连接酶。[0757]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)包含不大于约50％(w/w)、45％(w/w)、40％(w/w)、35％(w/w)、30％(w/w)、25％(w/w)、20％(w/w)、19％(w/w)、18％(w/w)、17％(w/w)、16％(w/w)、15％(w/w)、14％(w/w)、13％(w/w)、12％(w/w)、11％(w/w)、10％(w/w)、9％(w/w)、8％(w/w)、7％(w/w)、6％(w/w)、5％(w/w)、4％(w/w)、3％(w/w)、2％(w/w)、1％(w/w)的至少一种酶，例如聚合酶，例如rna聚合酶。[0758]在一个实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)是无菌的或基本上不含微生物，例如组合物或制剂如在无菌条件下所测试支持少于100个活微生物的生长，组合物或制剂满足usp《71》的标准，和/或组合物或制剂满足usp《85》的标准。在一些实施例中，药物制剂在灭菌之前包含少于100cfu/100ml、50cfu/100ml、40cfu/100ml、30cfu/100ml、200cfu/100ml、10cfu/100ml、或10cfu/100ml的生物负荷。[0759]在一些实施例中，可以使用本领域中已知的去除杂质的技术(诸如柱色谱法或ph/小瓶灭活)进一步纯化环状多核糖核苷酸制剂。[0760]在一些实施例中，当环状多核糖核苷酸制剂已经历过纯化步骤(或多个纯化步骤)时，环状多核糖核苷酸制剂在施用至受试者之后产生与在该一个或多个纯化步骤之前相比降低水平的免疫或炎性反应的一种或多种标记物。在一些实施例中，该免疫或炎性反应的一种或多种标记物是细胞因子或免疫反应相关基因。在一些实施例中，该免疫或炎性反应的一种或多种标记物是诸如rig-i、mda5、pkr、ifn-β、oas、和oasl等基因的表达。[0761]在一个实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)表达表达产物，例如蛋白质，例如体外翻译活性。[0762]递送[0763]本文所述的环状或线性多核糖核苷酸也可以包括在含载剂或不含载剂的药物组合物中。[0764]本文所述的药物组合物可以是配制的，例如包含载剂(诸如药物载剂和/或聚合物载剂，例如脂质体)，并通过已知方法递送至有需要的受试者(例如人或非人农业动物或家畜，例如牛、狗、猫、马、家禽)。此类方法包括但不限于转染(例如，脂质介导的阳离子聚合物、磷酸钙、树状聚合物)；电穿孔或其他破坏膜的方法(例如，核转染)、病毒递送(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、aav)、显微注射、微粒轰击(“基因枪”)、fugene、直接声波加载、细胞挤压、光转染、原生质体融合、刺穿感染、磁转染、外来体介导的转移、脂质纳米颗粒介导的转移、及其任何组合。递送方法也描述于例如gori等人,deliveryandspecificityofcrispr/cas9genomeeditingtechnologiesforhumangenetherapy[人类基因治疗用crispr/cas9基因组编辑技术的传递和特异性].humangenetherapy[人类基因治疗].2015年7月,26(7):443-451.doi:10.1089/hum.2015.074；和zuris等人,cationiclipid-mediateddeliveryofproteinsenablesefficientprotein-basedgenomeeditinginvitroandinvivo[阳离子脂质介导的蛋白质递送能够在体外和体内进行有效的基于蛋白质的基因组编辑].natbiotechnol[自然－生物技术].2014年10月30日；33(1):73-80。[0765]在一些实施例中，可以以“裸”递送配制品递送环状或线性多核糖核苷酸。裸递送配制品将环状多核糖核苷酸递送至细胞，无需借助于载剂并且无需对环状或线性多核糖核苷酸进行共价修饰，也无需对环状或线性多核糖核苷酸进行部分或完全包封。[0766]裸递送配制品是不含载剂的配制品并且其中环状或线性多核糖核苷酸没有结合有助于递送至细胞的部分的共价修饰，并且环状或线性多核糖核苷酸没有部分或完全包封。在一些实施例中，没有与有助于递送至细胞的部分结合的共价修饰的环状或线性多核糖核苷酸可以是未与诸如蛋白质、小分子、颗粒、聚合物或有助于递送至细胞的生物聚合物的部分共价结合的多核糖核苷酸。在一些实施例中，可以将环状或线性多核糖核苷酸与鱼精蛋白或鱼精蛋白盐(例如硫酸鱼精蛋白)一起在递送配制品中递送。[0767]没有与有助于递送至细胞的部分结合的共价修饰的多核糖核苷酸可以不含经修饰的磷酸基团。例如，没有与有助于递送至细胞的部分结合的共价修饰的多核糖核苷酸可以不含硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼代磷酸盐、硼代磷酸酯、磷酸氢盐、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯或磷酸三酯。[0768]在一些实施例中，裸递送配制品可以不含以下任何或全部物质：转染试剂、阳离子载剂、碳水化合物载剂、纳米颗粒载剂或蛋白质载剂。例如，裸递送配制品可以不含植物糖原辛烯基琥珀酸酯、植物糖原β-糊精、酸酐改性的植物糖原β-糊精、脂转染胺(lipofectamine)、聚乙烯亚胺、聚(三甲基亚胺)、聚(四甲基亚胺)、聚丙烯亚胺、氨基糖苷-聚胺、双脱氧-二氨基-b-环糊精、精胺、亚精胺、聚甲基丙烯酸(2-二甲基氨基)乙酯、聚(赖氨酸)、聚(组氨酸)、聚(精氨酸)、阳离子明胶、树状聚合物、壳聚糖、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(dotap)、n-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(dotma)、1-[2-(油酰氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羟乙基)咪唑鎓氯化物(dotim)、2,3-二油酰氧基-n-[2(精胺甲酰胺基)乙基]-n,n-二甲基-1-三氟乙酸丙铵(dospa)、3b-[n-(n,n'-二甲氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐(dc-胆固醇盐酸盐)、二-十七烷基氨基甘氨酰基亚精胺(dogs)、n,n-二硬脂基-n,n-二甲基溴化铵(ddab)、n-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-n,n-二甲基-n-羟乙基溴化铵(dmrie)、n,n-二油基-n,n-二甲基氯化铵(dodac)、人血清白蛋白(hsa)、低密度脂蛋白(ldl)、高密度脂蛋白(hdl)或球蛋白。[0769]裸递送配制品可以包含非载剂赋形剂。在一些实施例中，非载剂赋形剂可以包括不表现出活性细胞穿透作用的非活性成分。在一些实施例中，非载剂赋形剂可以包括缓冲剂，例如pbs。在一些实施例中，非载剂赋形剂可以是溶剂、非水性溶剂、稀释剂、悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、聚合物、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶、分散剂、制粒剂、崩解剂、粘合剂、缓冲剂、润滑剂、或油。[0770]在一些实施例中，裸递送配制品可以包含稀释剂，诸如肠胃外可接受的稀释剂。稀释剂(例如，肠胃外可接受的稀释剂)可以是液体稀释剂或固体稀释剂。在一些实施例中，稀释剂(例如，肠胃外可接受的稀释剂)可以是rna增溶剂、缓冲剂或等渗剂。rna增溶剂的实例包括水、乙醇、甲醇、丙酮、甲酰胺和2-丙醇。缓冲剂的实例包括2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)、bis-tris、2-[(2-氨基-2-氧代乙基)-(羧甲基)氨基]乙酸(ada)、n-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸(aces)、哌嗪-n,n′‑双(2-乙磺酸)(pipes)、2-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基]氨基]乙磺酸(tes)、3-(n-吗啉代)丙烷磺酸(mops)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)、tris、tricine、gly-gly、bicine或磷酸盐。等渗剂的实例包括甘油、甘露醇、聚乙二醇、丙二醇、海藻糖或蔗糖。[0771]在一些实施例中，如本文披露的药物制剂、如本文披露的药物组合物、如本文披露的药物原料药或如本文披露的药物成品药处于肠胃外核酸递送系统中。肠胃外核酸递送系统可以包括如本文披露的药物制剂、如本文披露的药物组合物、所披露的药物原料药或如本文披露的药物成品药和肠胃外可接受的稀释剂。在一些实施例中，肠胃外核酸递送系统中的如本文披露的药物制剂、如本文披露的药物组合物、如本文披露的药物原料药或如本文披露的药物成品药不含任何载剂。[0772]本披露进一步涉及包含本文所述的环状或线性多核糖核苷酸的宿主或宿主细胞。在一些实施例中，宿主或宿主细胞是脊椎动物、哺乳动物(例如人)或其他生物体或细胞。[0773]在一些实施例中，与由参考化合物(例如对应于所述环状多核糖核苷酸的线性多核苷酸或缺少加密原的环状多核糖核苷酸)触发的反应相比，环状多核糖核苷酸降低或不能产生宿主免疫系统的不需要的反应。在实施例中，环状多核糖核苷酸在宿主中是非免疫原性的。一些免疫反应包括但不限于体液免疫反应(例如，免疫原特异性抗体的产生)和细胞介导的免疫反应(例如，淋巴细胞增殖)。[0774]在一些实施例中，使宿主或宿主细胞接触(例如，递送或施用)环状多核糖核苷酸或线性多核糖核苷酸。在一些实施例中，宿主是哺乳动物，诸如人。可以在施用后的任何时间测量宿主中环状多核糖核苷酸或线性多核糖核苷酸、表达产物或两者的量。在某些实施例中，测定培养物中宿主生长的时程。如果在环状多核糖核苷酸或线性多核糖核苷酸的存在下生长增加或减少，则环状多核糖核苷酸或表达产物或两者都被认为在增加或减少宿主的生长方面是有效的。[0775]将如本文所述的环状或线性多核糖核苷酸分子递送至细胞、组织或受试者的方法包括将如本文所述的药物组合物、药物原料药或药物成品药施用于细胞、组织或受试者。[0776]在一些实施例中，细胞是真核细胞。在一些实施例中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施例中，细胞是有蹄动物细胞。在一些实施例中，细胞是动物细胞。在一些实施例中，细胞是免疫细胞。在一些实施例中，组织是结缔组织、肌肉组织、神经组织或上皮组织。在一些实施例中，组织是器官(例如，肝、肺、脾、肾等)。[0777]在一些实施例中，递送方法是体内方法。例如，如本文所述的环状多核糖核苷酸的递送方法包括向有需要的受试者肠胃外施用，将如本文所述的药物组合物、药物原料药或药物成品药经肠胃外施用给有需要的受试者。再如，将环状多核糖核苷酸递送至受试者的细胞或组织的方法包括将如本文所述的药物组合物、药物原料药或药物成品药肠胃外施用至该细胞或组织。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的量在受试者中有效地引发生物反应。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的量有效地对受试者的细胞或组织具有生物学作用。在一些实施例中，如本文所述的药物组合物、药物原料药或药物成品药包含载剂。在一些实施例中，如本文所述的药物组合物、药物原料药或药物成品药包含稀释剂而不含任何载剂。[0778]在一些实施例中，肠胃外施用药物组合物、药物原料药或药物成品药。在一些实施例中，药物组合物、药物原料药或药物成品药通过静脉内、动脉内、腹膜内、皮内、颅内、鞘内、淋巴内、皮下或肌内施用。在一些实施例中，肠胃外施用是静脉内、肌内、眼、皮下、皮内或局部施用。[0779]在一些实施例中，如本文所述的药物组合物、药物原料药或药物成品药经肌内施用。在一些实施例中，如本文所述的药物组合物、药物原料药或药物成品药经皮下施用。在一些实施例中，如本文所述的药物组合物、药物原料药或药物成品药局部施用。在一些实施例中，该药物组合物、药物原料药或药物成品药经气管内施用。[0780]在一些实施例中，该药物组合物、药物原料药或药物成品药通过注射施用。施用可以是全身施用或局部施用。在一些实施例中，如本文所述的任何递送方法均用载剂进行。在一些实施例中，无需借助于载剂或细胞穿透剂即可进行如本文所述的任何递送方法。[0781]在一些实施例中，在施用步骤后至少1天、至少2天、至少3天、至少4天或至少5天在细胞、组织或受试者中检测到环状多核糖核苷酸或从该环状多核糖核苷酸翻译的产物。在一些实施例中，在施用步骤之前评价细胞、组织或受试者中环状多核糖核苷酸或从该环状多核糖核苷酸翻译的产物的存在。在一些实施例中，在施用步骤之后评价细胞、组织或受试者中环状多核糖核苷酸或从该环状多核糖核苷酸翻译的产物的存在。[0782]配制品[0783]在一些实施例中，本文披露的药物配制品可以包含：(i)本文披露的化合物(例如，环状多核糖核苷酸)；(ii)缓冲剂；(iii)非离子型洗涤剂；(iv)张度剂；和/或(v)稳定剂。在一些实施例中，本文披露的药物配制品可以包含：(i)本文披露的化合物(例如，线性多核糖核苷酸)；(ii)缓冲剂；(iii)非离子型洗涤剂；(iv)张度剂；和/或(v)稳定剂。在一些实施例中，本文披露的药物配制品是稳定的液体药物配制品。在一些实施例中，本文披露的药物配制品包含鱼精蛋白或鱼精蛋白盐(例如，硫酸鱼精蛋白)。[0784]本披露提供了包括本文所述的环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物。本披露提供了包括本文所述的线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物。本披露的免疫原性组合物可以包含稀释剂或载剂、佐剂或其任何组合。本披露的免疫原性组合物还可以包含一种或多种免疫调节剂，例如一种或多种佐剂。佐剂可以包括下面进一步讨论的th1佐剂和/或th2佐剂。在一些实施例中，免疫原性组合物包含不含任何载剂的稀释剂，并且用于将环状多核糖核苷酸裸递送至受试者。在一些实施例中，免疫原性组合物包含不含任何载剂的稀释剂，并且用于将线性多核糖核苷酸裸递送至受试者。[0785]本披露的免疫原性组合物用于在受试者中引起免疫反应。免疫反应优选是保护性的，并且优选涉及抗体反应(通常包括igg)和/或细胞介导的免疫反应。例如，用包括本披露的环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物使受试者免疫以诱导免疫反应。再如，用包括含免疫原的线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物使受试者免疫，以刺激与免疫原结合的抗体的产生。通过这些用途和方法在受试者中引起免疫反应，可以保护受试者免受各种疾病和/或感染，例如免受如上所讨论的细菌和/或病毒疾病。在某些实施例中，免疫原性组合物是疫苗组合物。根据本披露的疫苗可以是预防性的(即预防感染)或治疗性的(即治疗感染)，但是通常将是预防性的。在一些实施例中，受试者是哺乳动物。在一些实施例中，受试者是动物，优选哺乳动物，例如人。在一个实施例中，受试者是人。在其他实施例中，受试者是非人哺乳动物，例如选自牛(例如，奶牛和肉牛)、绵羊、山羊、猪、马、狗或猫。在其他实施例中，受试者是鸟，例如母鸡或公鸡、火鸡、鹦鹉。在一些实施例中，动物不是小鼠或兔子或牛。在一个特定实施例中，在免疫原性组合物用于预防用途的情况下，人是儿童(例如，幼儿或婴儿)或青少年。在另一个实施例中，在免疫原性组合物用于治疗用途的情况下，人是青少年或成人。旨在用于儿童的免疫原性组合物也可以施用给成人，例如以评估安全性、剂量、免疫原性等。[0786]根据本披露制备的免疫原性组合物可用于治疗儿童和成人。人类受试者可小于1岁、小于5岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。在一个特定实施例中，接受免疫原性组合物的人类受试者是老年人(例如，≥50岁、≥60岁和≥65岁)、年轻人(例如，≤5岁)、住院患者、医护人员、武装部队和军事人员、孕妇、长期病患者或免疫缺陷患者。然而，免疫原性组合物不仅仅适合于这些群组，并且可以更普遍地用于群体中。[0787]在一些实施例中，受试者进一步用佐剂免疫接种。在一些实施例中，受试者进一步用疫苗免疫接种。[0788]免疫接种[0789]在一些实施例中，本披露的方法包括用包含本文披露的环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物为受试者免疫接种。在一些实施例中，免疫原由环状多核糖核苷酸表达。在一些实施例中，免疫接种在受试者中诱导针对由环状多核糖核苷酸表达的免疫原的免疫反应。在一些实施例中，免疫接种在受试者中诱导免疫反应(例如，诱导与由环状多核糖核苷酸表达的免疫原结合的抗体的产生)。在一些实施例中，免疫原性组合物在单一组合物中包含环状多核糖核苷酸和稀释剂、载剂、第一佐剂或其组合。在一些实施例中，受试者进一步用第二佐剂免疫接种。在一些实施例中，受试者进一步用疫苗免疫接种。[0790]在一些实施例中，本披露的方法包括用包含本文披露的线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物为受试者免疫接种。在一些实施例中，免疫原由线性多核糖核苷酸表达。在一些实施例中，免疫接种在受试者中诱导针对由线性多核糖核苷酸表达的免疫原的免疫反应。在一些实施例中，免疫接种诱导与由线性多核糖核苷酸表达的免疫原结合的抗体的产生。在一些实施例中，免疫接种诱导细胞介导的免疫反应。在一些实施例中，免疫原性组合物在单一组合物中包含线性多核糖核苷酸和稀释剂、载剂、第一佐剂或其组合。在一些实施例中，受试者进一步用第二佐剂免疫接种。在一些实施例中，受试者进一步用疫苗免疫接种。[0791]受试者用包含任何数量的环状多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。受试者用例如包含至少1种环状多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。具有非人源化免疫系统的非人动物用例如包含至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少20种不同的环状多核糖核苷酸或更多种不同的环状多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。在一些实施例中，受试者用包含至多1种环状多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。在一些实施例中，具有人源化免疫系统的非人动物用包含至多2种、至多3种、至多4种、至多5种、至多6种、至多7种、至多8种、至多9种、至多10种、至多11种、至多12种、至多13种、至多14种、至多15种、至多20种不同的环状多核糖核苷酸或少于21种不同的环状多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。在一些实施例中，受试者用包含约1种环状多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。在一些实施例中，具有人源化免疫系统的非人动物用包含约2种、约3种、约4种、约5种、约6种、约7种、约8种、约9种、约10种、约11种、约12种、约13种、约14种、约15种或约20种不同的环状多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。在一些实施例中，受试者用包含约1-20、1-15、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-20、2-15、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-20、3-15、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-20、4-15、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、4-4、4-3、5-20、5-15、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、5-10、10-15或15-20种不同的环状多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。不同的环状多核糖核苷酸具有彼此不同的序列。例如，它们可以包括或编码不同的免疫原、重叠的免疫原、相似的免疫原或相同的免疫原(例如，具有相同或不同的调控元件、起始序列、启动子、终止元件或本披露的其他元件)。在受试者用包含两种或更多种不同的环状多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种的情况下，这两种或更多种不同的环状多核糖核苷酸可以处于相同或不同的免疫原性组合物中并且同时或在不同时间免疫接种。可以将包含两种或更多种不同的环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物施用于相同的解剖位置或不同的解剖位置。[0792]受试者可以用包含任何数量的线性多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。受试者用例如包含至少1种线性多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。具有非人源化免疫系统的非人动物用例如包含至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少20种不同的线性多核糖核苷酸或更多种不同的线性多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。在一些实施例中，受试者用包含至多1种线性多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。在一些实施例中，具有人源化免疫系统的非人动物用包含至多2种、至多3种、至多4种、至多5种、至多6种、至多7种、至多8种、至多9种、至多10种、至多11种、至多12种、至多13种、至多14种、至多15种、至多20种不同的线性多核糖核苷酸或少于21种不同的线性多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。在一些实施例中，受试者用包含约1种线性多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。在一些实施例中，具有人源化免疫系统的非人动物用包含约2种、约3种、约4种、约5种、约6种、约7种、约8种、约9种、约10种、约11种、约12种、约13种、约14种、约15种或约20种不同的线性多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。在一些实施例中，受试者用包含约1-20、1-15、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-20、2-15、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-20、3-15、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-20、4-15、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、4-4、4-3、5-20、5-15、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、5-10、10-15或15-20种不同的线性多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。不同的线性多核糖核苷酸可以具有彼此不同的序列。例如，它们可以包括或编码不同的免疫原、重叠的免疫原、相似的免疫原或相同的免疫原(例如，具有相同或不同的调控元件、起始序列、启动子、终止元件或本披露的其他元件)。在受试者用包含两种或更多种不同的线性多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种的情况下，这两种或更多种不同的线性多核糖核苷酸可以处于相同或不同的免疫原性组合物中并且同时或在不同时间免疫接种。可以将包含两种或更多种不同的线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物施用于相同的解剖位置或不同的解剖位置。[0793]这两种或更多种不同的线性多核糖核苷酸可以包括或编码来自相同来源、不同来源或本文披露的来源的不同组合的免疫原。这两种或更多种不同的线性多核糖核苷酸可以包括或编码来自相同病毒或来自不同病毒(例如，不同分离株)的免疫原。[0794]在一些实施例中，受试者用如本文披露的包含任何数量的环状多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物和包含任何数量的线性多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。在一些实施例中，本文披露的免疫原性组合物包含如本文披露的一种或多种环状多核糖核苷酸和一种或多种线性多核糖核苷酸。[0795]在一些实施例中，免疫原性组合物包含环状多核糖核苷酸和稀释剂、载剂、第一佐剂或其组合。在一个特定实施例中，免疫原性组合物包含本文所述的环状多核糖核苷酸和载剂或不含任何载剂的稀释剂。在一些实施例中，包含环状多核糖核苷酸与不含任何载剂的稀释剂的免疫原性组合物用于将环状多核糖核苷酸裸递送至受试者。在另一个特定实施例中，免疫原性组合物包含本文所述的环状多核糖核苷酸和第一佐剂。[0796]在某些实施例中，进一步向受试者施用第二佐剂。佐剂增强先天免疫反应，继而增强受试者中的适应性免疫反应。佐剂可以是如下所讨论的任何佐剂。在某些实施例中，佐剂作为免疫原性组合物的一部分与环状多核糖核苷酸一起配制。在某些实施例中，佐剂不是包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物的一部分。在某些实施例中，佐剂与包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物分开施用。在这方面，佐剂与包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物共同施用(例如同时施用)或在不同的时间施用给受试者。例如，在包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物之后1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时，或介于之间的任何分钟数或小时数，施用佐剂。在一些实施例中，在包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物之前1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时，或介于之间的任何分钟数或小时数，施用佐剂。例如，在包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物之后1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介于之间的任何天数，施用佐剂。在一些实施例中，在包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物之前1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介于之间的任何天数，施用佐剂。将佐剂施用到与包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物相同的解剖位置或不同的解剖位置。[0797]在一些实施例中，免疫原性组合物包含线性多核糖核苷酸和稀释剂、载剂、第一佐剂或其组合。在一个特定实施例中，免疫原性组合物包含本文所述的线性多核糖核苷酸和载剂或不含任何载剂的稀释剂。在一些实施例中，包含线性多核糖核苷酸与不含任何载剂的稀释剂的免疫原性组合物用于将线性多核糖核苷酸裸递送至受试者。在另一个特定实施例中，免疫原性组合物包含本文所述的线性多核糖核苷酸和第一佐剂。[0798]在某些实施例中，进一步向受试者施用第二佐剂。佐剂增强先天免疫反应，继而增强受试者中的适应性免疫反应。佐剂可以是如下所讨论的任何佐剂。在某些实施例中，佐剂作为免疫原性组合物的一部分与线性多核糖核苷酸一起配制。在某些实施例中，佐剂不是包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物的一部分。在某些实施例中，佐剂与包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物分开施用。在这方面，佐剂与包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物共同施用(例如同时施用)或在不同的时间施用给受试者。例如，在包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物之后1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时，或介于之间的任何分钟数或小时数，施用佐剂。在一些实施例中，在包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物之前1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时，或介于之间的任何分钟数或小时数，施用佐剂。例如，在包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物之后1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介于之间的任何天数，施用佐剂。在一些实施例中，在包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物之前1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介于之间的任何天数，施用佐剂。将佐剂施用到与包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物相同的解剖位置或不同的解剖位置。[0799]在一些实施例中，受试者用第二试剂，例如不是环状多核糖核苷酸的疫苗(如下所述)进一步免疫接种。该疫苗与包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物共同施用(例如同时施用)或在不同的时间施用给受试者。例如，在包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物之后1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时，或介于之间的任何分钟数或小时数，施用该疫苗。在一些实施例中，在包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物之前1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时，或介于之间的任何分钟数或小时数，施用该疫苗。例如，在包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物之后1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介于之间的任何天数，施用该疫苗。在一些实施例中，在包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物之前1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介于之间的任何天数，施用该疫苗。[0800]在一些实施例中，受试者用第二试剂，例如不是线性多核糖核苷酸的疫苗(如下所述)进一步免疫接种。该疫苗与包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物共同施用(例如同时施用)或在不同的时间施用给受试者。例如，在包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物之后1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时，或介于之间的任何分钟数或小时数，施用该疫苗。在一些实施例中，在包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物之前1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时，或介于之间的任何分钟数或小时数，施用该疫苗。例如，在包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物之后1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介于之间的任何天数，施用该疫苗。在一些实施例中，在包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物之前1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介于之间的任何天数，施用该疫苗。[0801]受试者可以用免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合免疫接种任何合适的次数，以实现所需的反应。例如，初免-加强免疫接种策略可用于引发全身和/或粘膜免疫。受试者可以用本披露的免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合免疫接种，例如至少1次、至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次、至少9次、至少10次或至少15次或更多次。[0802]在一些实施例中，受试者可以用本披露的免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合免疫接种，至多2次、至多3次、至多4次、至多5次、至多6次、至多7次、至多8次、至多9次、至多10次、至多15次或至多20次或更少次。[0803]在一些实施例中，受试者可以用本披露的免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合免疫接种约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20次。[0804]在一些实施例中，受试者可以用本披露的免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合免疫接种一次。在一些实施例中，受试者可以用本披露的免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合免疫接种两次。在一些实施例中，受试者可以用本披露的免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合免疫接种三次。在一些实施例中，受试者可以用本披露的免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合免疫接种四次。在一些实施例中，受试者可以用本披露的免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合免疫接种五次。在一些实施例中，受试者可以用本披露的免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合免疫接种七次。[0805]可以选择合适的时间间隔以间隔两次或更多次免疫接种。该时间间隔可以适用于用相同免疫原性组合物、佐剂或疫苗(例如蛋白质亚基疫苗)或其组合进行多次免疫接种，例如，相同免疫原性组合物、佐剂或疫苗(例如蛋白质亚基疫苗)或其组合可以经由相同的免疫接种途径或不同的免疫接种途径以相同的量或不同的量施用。该时间间隔可以适用于用不同免疫原性组合物、佐剂或疫苗(例如蛋白质亚基疫苗)或其组合进行多次免疫接种，例如，不同免疫原性组合物、佐剂或疫苗(例如蛋白质亚基疫苗)或其组合可以经由相同的免疫接种途径或不同的免疫接种途径以相同的量或不同的量施用。该时间间隔可适用于用不同试剂，例如，包含第一环状多核糖核苷酸的第一免疫原性组合物和包含第二环状多核糖核苷酸的第二免疫原性组合物进行免疫接种。该时间间隔可适用于用不同试剂，例如，包含第一环状多核糖核苷酸的第一免疫原性组合物和包含蛋白质免疫原(例如，蛋白质亚基)的第二免疫原性组合物进行免疫接种。该时间间隔可以适用于包含第一线性多核糖核苷酸的第一免疫原性组合物和包含第二线性多核糖核苷酸的第二免疫原性组合物。对于包括三次或更多次免疫接种的方案，免疫接种的时间间隔可以相同或不同。在一些实例中，两次免疫接种之间经过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、16、17、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、40、48或72小时。在一些实施例中，两次免疫接种之间经过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、16、17、18、20、21、24、28或30天。在一些实施例中，两次免疫接种之间经过约1、2、3、4、5、6、7或8周。在一些实施例中，两次免疫接种之间经过约1、2、3、4、5、6、7或8个月。[0806]在一些实施例中，两次免疫接种之间经过至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少9小时、至少10小时、至少15小时、至少20小时、至少24小时、至少36小时或至少72小时或更长时间。在一些实施例中，两次免疫接种之间经过至多1小时、至多2小时、至多3小时、至多4小时、至多5小时、至多6小时、至多7小时、至多8小时、至多9小时、至多10小时、至多15小时、至多20小时、至多24小时、至多36小时或至多72小时或更少时间。[0807]在一些实施例中，两次免疫接种之间经过至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少15天、至少20天、至少21天、至少22天、至少23天、至少24天、至少25天、至少26天、至少27天、至少28天、至少29天或至少30天或更长时间。在一些实施例中，两次免疫接种之间经过至多2天、至多3天、至多4天、至多5天、至多6天、至多7天、至多8天、至多9天、至多10天、至多15天、至多20天、至多21天、至多22天、至多23天、至多24天、至多25天、至多26天、至多27天、至多28天、至多29天、至多30天、至多32天、至多34天或至多36天或更少时间。[0808]在一些实施例中，两次免疫接种之间经过至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周或至少8周或更长时间。在一些实施例中，两次免疫接种之间经过至多2周、至多3周、至多4周、至多5周、至多6周、至多7周、至多8周或更少时间。[0809]在一些实施例中，两次免疫接种之间经过至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月或至少8个月或更长时间。在一些实施例中，两次免疫接种之间经过至多2个月、至多3个月、至多4个月、至多5个月、至多6个月、至多7个月、至多8个月、至多9个月、至多10个月、至多11个月或至多12个月或更少时间。[0810]在一些实施例中，该方法包括向受试者预施用一种试剂以改善对包含编码免疫原的序列的环状多核糖核苷酸的免疫原性反应。在一些实施例中，该试剂是如本文披露的免疫原(例如，蛋白质免疫原)。例如，该方法包括在施用包含编码蛋白质免疫原的序列的环状多核糖核苷酸前1至7天施用蛋白质免疫原。在一些实施例中，在施用包括编码蛋白质免疫原的序列的环状多核糖核苷酸前1、2、3、4、5、6或7天施用蛋白质免疫原。例如，该方法包括在施用包括编码蛋白质免疫原的序列的线性多核糖核苷酸前1至7天施用蛋白质免疫原。在一些实施例中，在施用包含编码蛋白质免疫原的序列的线性多核糖核苷酸前1、2、3、4、5、6或7天施用蛋白质免疫原。蛋白质免疫原可以作为蛋白质制剂施用，在质粒(pdna)中编码，存在于病毒样颗粒(vlp)中，以脂质纳米颗粒的形式配制等。[0811]在一些实施例中，该方法包括在向受试者施用了包含编码免疫原的序列的环状多核糖核苷酸之后，向受试者施用一种试剂以改善对包含编码免疫原的序列的环状多核糖核苷酸的免疫原性反应。在一些实施例中，该试剂是如本文披露的免疫原(例如，蛋白质免疫原)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含编码蛋白质免疫原的序列。例如，该方法包括在向受试者施用包含编码免疫原的序列的环状多核糖核苷酸的1年内(例如，在11个月、10个月、9个月、8个月、7个月、6个月、5个月、4个月、3个月、2个月和1个月内)施用蛋白质免疫原。在一些实施例中，该方法包括向受试者施用本文所述的任一种环状多核糖核苷酸或本文所述的任一种免疫原性组合物和蛋白质亚基。[0812]在一些实施例中，蛋白质免疫原具有与由环状多核糖核苷酸编码的免疫原相同的氨基酸序列。例如，多肽免疫原可对应于由环状多核糖核苷酸序列编码的多肽免疫原(例如，与之具有90％、95％、96％、97％、98％或100％的氨基酸序列同一性)。在一些实施例中，蛋白质免疫原具有与由环状多核糖核苷酸编码的免疫原的氨基酸序列不同的氨基酸序列。例如，多肽免疫原与由环状多核糖核苷酸序列编码的多肽免疫原具有少于90％(例如，80％、70％、30％、20％或10％)的氨基酸序列同一性。[0813]受试者可以在任何合适数目的解剖部位用免疫原性组合物、佐剂或疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合免疫接种。可以将相同的免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合施用于多个解剖部位，可以将包含相同或不同的环状多核糖核苷酸的不同免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合施用于不同的解剖部位，可以将包含相同或不同的环状多核糖核苷酸的不同免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合施用于相同的解剖部位，或其任何组合。例如，可以将包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物施用于两个不同的解剖部位，和/或可以将包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物施用于一个解剖部位，并且可以将佐剂施用于不同的解剖部位。可以将相同的免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合施用于多个解剖部位，可以将包括相同或不同的线性多核糖核苷酸的不同免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合施用于不同的解剖部位，可以将包括相同或不同的线性多核糖核苷酸的不同免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合施用于相同的解剖部位，或其任何组合。例如，可以将包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物施用于两个不同的解剖部位，和/或可以将包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物施用于一个解剖部位，并且可以将佐剂施用于不同的解剖部位。[0814]任何两个或更多个解剖途径的免疫接种可以经由相同的免疫接种途径(例如，肌内)或通过两个或更多个免疫接种途径来进行。在一些实施例中，将本披露的包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物、佐剂或疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合向受试者的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个解剖部位免疫接种。在一些实施例中，将本披露的包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物、佐剂或疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合向受试者的至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个或至多10个解剖部位或更少解剖部位免疫接种。在一些实施例中，将本披露的包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物或佐剂向受试者的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个解剖部位免疫接种。在一些实施例中，将本披露的包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物、佐剂或疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合向受试者的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个解剖部位免疫接种。在一些实施例中，将本披露的包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物、佐剂或疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合向受试者的至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个或至多10个解剖部位或更少解剖部位免疫接种。在一些实施例中，将本披露的包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物或佐剂向受试者的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个解剖部位免疫接种。[0815]免疫接种可以经由任何合适的途径。免疫接种途径的非限制性实例包括静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外、胸骨内、脑内、眼内、病灶内、脑室内、脑池内或实质内，例如注射和输注。在一些情况下，免疫接种可以经由吸入进行。可以通过相同或不同的途径进行两次或更多次免疫接种。[0816]可以向本披露的受试者施用任何适量的环状多核糖核苷酸。例如，受试者可以用至少约1ng、至少约10ng、至少约100ng、至少约1μg、至少约10μg、至少约100μg、至少约1mg、至少约10mg、至少约100mg或至少约1g的环状多核糖核苷酸免疫接种。在一些实施例中，受试者可以用至多约1ng、至多约10ng、至多约100ng、至多约1μg、至多约10μg、至多约100μg、至多约1mg、至多约10mg、至多约100mg或至多约1g的环状多核糖核苷酸免疫接种。在一些实施例中，受试者可以用约1ng、约10ng、约100ng、约1μg、约10μg、约100μg、约1mg、约10mg、约100mg或约1g的环状多核糖核苷酸免疫接种。[0817]在一些实施例中，该方法进一步包括评价受试者对免疫原的抗体反应。在一些实施例中，评价是在施用包含编码免疫原的序列的环状多核糖核苷酸之前和/或之后。在一些实施例中，评价是在施用包含编码免疫原的序列的线性多核糖核苷酸之前和/或之后。[0818]在一些实施例中，将本文所述的环状多核糖核苷酸、免疫原性组合物、药物制剂或药物组合物根据表1中提供的给药时间表施用于出生至15个月之间的受试者，或根据表2的给药时间表施用于18个月至18岁之间的受试者。给药可以根据本领域已知的给药时间表进行，例如，如疾病控制和预防中心(cdc)或美国国立卫生研究院(nih)所述。表1和表2提供了截至2020年8月29日cdc网站上指示的某些病症的疫苗接种给药时间表的简要汇总。[0819]表1.出生至15个月给药[0820][0821][0822]*任选[0823]表2.18个月至18岁给药[0824][0825]局部递送[0826]在一些方面，本披露提供了用于局部递送在受试者中产生免疫反应的多核糖核苷酸的组合物和药物组合物。这些组合物和药物组合物可以包含用于将多核糖核苷酸递送至细胞的醇(例如乙醇)。这些组合物和药物组合物可以包含细胞穿透剂。细胞穿透剂被配置成增强多核糖核苷酸向细胞中的递送。多核糖核苷酸可以线性或环状形式存在。[0827]在一些实施例中，本文所述的组合物或药物组合物直接施用至表面区域(例如，局部表面区域)。在一些实施例中，在施加灭菌剂后，将本文所述的组合物或药物组合物施加至受试者的表面区域。在一些实施例中，在施加醇后，将本文所述的组合物或药物组合物施加至受试者的表面区域。[0828]本文披露的组合物可以包括包含多核糖核苷酸和醇诸如乙醇的混合物。本文披露的方法可以包括在包含多核糖核苷酸和醇诸如乙醇的混合物的组合物中递送多核糖核苷酸。在一些方面，本披露提供了包含多核糖核苷酸和用于将多核糖核苷酸递送至细胞中的醇(例如，乙醇)的试剂盒。在一些实施例中，试剂盒包括灭菌剂。在特定实施例中，试剂盒包括多核糖核苷酸和醇擦拭物(例如，乙醇擦拭物、异丙基擦拭物)。[0829]本文披露的组合物可以包括包含多核糖核苷酸和细胞穿透剂的混合物。本文披露的方法可以包括在包含多核糖核苷酸和细胞穿透剂的混合物的组合物中递送多核糖核苷酸。在一些方面，本披露提供了包含多核糖核苷酸和用于将多核糖核苷酸递送至细胞中的细胞穿透剂的试剂盒。在一些实施例中，试剂盒包括灭菌剂。[0830]本文披露的组合物可以是包含多核糖核苷酸和稀释剂而不含任何载剂的组合物。该组合物可用于递送至上皮细胞的方法中。[0831]在一些实施例中，本文所述的组合物、治疗组合物或药物组合物直接施用至表面区域(例如，局部表面区域)。在一些实施例中，在施加灭菌剂后，将本文所述的组合物、治疗组合物或药物组合物施加至受试者的表面区域。[0832]本文提供的组合物、方法和试剂盒可以提供简单有效的将多核糖核苷酸递送至细胞中的解决方案。与不存在细胞穿透剂相比，在存在细胞穿透剂的情况下，多核糖核苷酸可以更有效地递送至细胞中。在一些情况下，与不存在细胞穿透剂的情况下的多核苷酸递送效率相比，本文所述的细胞穿透剂可使多核苷酸递送效率增加至少约10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、200％、250％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、2000％、5000％、8000％、10,000％、20,000％或50,000％。[0833]如本文所用，术语“局部递送”意指将物质递送至皮肤或可通过非侵入性方式接近的上皮层。局部递送包括局部递送至肠和其他胃肠(gi)上皮或阴道上皮。药物组合物的局部递送可以对受试者具有局部药效学作用，例如，局部递送的药物组合物在递送药物组合物的身体特定部位(例如皮肤)处或其附近具有药效学作用。在一些其他实施例中，如本文所讨论的药物组合物的局部递送仅用于指递送模式(局部递送至例如特定表面区域)，而药物组合物可以具有局部或全身药效学作用。例如，药物组合物可以停留在施用部位的局部或附近，或者可以进入受试者身体的循环系统(例如，血液或淋巴系统)，通过该循环系统，药物组合物可以被运输至身体的远端部分，这些远端部分通常是药物组合物经由循环系统以外的途径不能到达的。[0834]在一些实施例中，本文所述的组合物或药物组合物被配制用于直接施加在皮肤区域上(例如，经皮或皮肤施用)。在一些实施例中，本文所述的组合物或药物组合物被配制用于经由受试者的鼻腔通道施用。在一些实施例中，本文所述的组合物或药物组合物被配制用于口腔施用。在一些实施例中，本文所述的组合物或药物组合物被配制用于眼部施用。在一些实施例中，本文所述的组合物或药物组合物被配制用于作为栓剂施用，用于阴道施用或用于粘膜施用。[0835]本文所述的组合物或药物组合物可以在将灭菌剂施加至表面后再施加至该表面(例如，用灭菌剂预处理该表面以递送多核糖核苷酸)。该表面可以是受试者的表面区域。受试者的表面区域包括细胞，诸如上皮细胞。[0836]灭菌剂可以是杀菌、抑菌和/或主动杀灭微生物、灭活微生物或防止微生物生长的任何试剂。在一些实施例中，灭菌剂是醇、碘或过氧化氢。灭菌剂可以是紫外光或激光。在一些实施例中，灭菌剂是以电的方式或通过其他方式诸如通过蒸气或接触传递的热。[0837]灭菌剂可以通过各种非侵入性方法施加至受试者的表面区域。例如，灭菌剂可以通过包含灭菌剂的擦拭物或拭子施加。在一些实施例中，灭菌剂作为喷雾而施加。可以使用各种装置来施加灭菌剂。例如，可以使用产生紫外光或激光的装置。在其他实施例中，可以使用产生热量的装置。[0838]本文所述的组合物或药物组合物可以在施加醇诸如乙醇后施加至表面(例如，用醇预处理表面以递送多核糖核苷酸)。该表面可以是受试者的表面区域。受试者的表面区域包括细胞，诸如上皮细胞。用于在将多核糖核苷酸施用(例如，施加)到表面之前预处理该表面的醇可充当灭菌剂和/或增强多核糖核苷酸的细胞渗透。在一些实施例中，醇以擦拭物或调换物的形式施加至表面。在一些实施例中，允许醇在施用(例如，施加)多核糖核苷酸之前在表面上试用。[0839]本文所述的组合物或药物组合物可以是液体制剂，诸如悬浮液、糖浆或酏剂。在一些情况下，将水溶液包装以按原样使用，或冻干，并在施用之前将冻干制剂与无菌溶液组合。组合物可以以溶液或悬浮液的形式递送。通常，诸如凝胶(例如，dmso凝胶)、胶冻、乳膏、润肤露(例如，强生润肤露)、栓剂和软膏等配制品可以使区域更长时间暴露于一种或多种活性剂，而溶液中的配制品(例如，喷雾)可以提供更立即的短期暴露。[0840]预处理后施加至表面区域的组合物或药物组合物可以不含任何载剂，而包含多核糖核苷酸和稀释剂。多核糖核苷酸可以是线性多核糖核苷酸或环状多核糖核苷酸。[0841]在一些情况下，本文提供的组合物适于体内使用，以在将该组合物施用于受试者时引发针对目标免疫原的免疫反应。多核糖核苷酸可以线性或环状形式存在。[0842]在一个特定实施例中，如本文所述的组合物和药物组合物(例如，配制用于局部递送)可用于诱导针对病毒免疫原的免疫反应和/或用于治疗或预防病毒感染，例如选自以下的病毒感染：流感(例如，季节性流感、大流行性流感、甲型流感、流感h1n1亚型)、天花、基孔肯雅病毒(例如基孔肯雅病毒)、冠状病毒(例如，sars-cov-2)、登革热、寨卡、黄热病毒、柯萨奇病毒(例如手足口病)、hiv、aids、埃博拉病毒(例如，埃博拉出血热)、马尔堡病毒(例如马堡出血热)、病毒性细支气管炎、呼吸道合胞病毒(rsv)、肝炎病毒(例如乙型肝炎)、疱疹病毒(例如生殖器疱疹)、轮状病毒感染、麻疹感染、腮腺炎感染和风疹感染。[0843]在另一个实施例中，如本文所述的组合物和药物组合物(例如配制用于局部递送)可用于诱导针对细菌免疫原的免疫反应和/或用于治疗或预防细菌感染，例如选自以下的细菌感染：q热、天花、百日咳(百日咳)、流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenzae)、链球菌(例如链球菌肺炎)、大肠杆菌感染、细菌性腹泻、土拉弗朗西斯菌(francisellatularensis)(例如土拉菌病)、白喉和破伤风。[0844]在另一个实施例中，如本文所述的组合物和药物组合物(例如配制用于局部递送)可用于诱导针对寄生虫免疫原的免疫反应和/或用于治疗或预防寄生虫感染，例如疟疾。[0845]在另一个实施例中，如本文所述的组合物和药物组合物(例如配制用于局部递送)可用于诱导针对毒素的免疫反应和/或用于治疗或预防与暴露于毒素(例如选自肉毒杆菌毒素和炭疽的毒素)相关的毒性。[0846]在另一个实施例中，如本文所述的组合物和药物组合物(例如配制用于局部递送)可用于诱导针对过敏原的免疫反应和/或用于治疗或预防与暴露于过敏原相关的症状，该过敏原例如选自花生过敏原、食物过敏原、桦树花粉过敏原、草花粉过敏原、猫过敏原、雪松花粉过敏原、尘螨过敏原和豚草过敏原的过敏原。[0847]在另一个实施例中，如本文所述的组合物和药物组合物可以配制用于透皮递送。在一些实施例中，透皮递送可用于诱导针对以下任一项的免疫反应和/或用于治疗或预防以下任一项：q热、天花、花生过敏原、肉毒杆菌毒素、病毒性细支气管炎、呼吸道合胞病毒(rsv)、炭疽、破伤风和尘螨过敏原。[0848]在另一个实施例中，如本文所述的组合物和药物组合物可以配制用于皮肤递送。在一些实施例中，皮肤递送可用于诱导针对以下任一项的免疫反应和/或用于治疗或预防以下任一项：流感(例如，季节性流感、大流行性流感、甲型流感、流感h1n1亚型)、天花、基孔肯雅病毒(例如基孔肯雅病毒)、冠状病毒(例如，sars-cov-2)、登革热、寨卡、黄热病毒、柯萨奇病毒(例如，手足口病)、hiv、aids、埃博拉病毒(例如埃博拉出血热)、马尔堡病毒(例如，马堡出血热)、呼吸道合胞病毒(rsv)、肝炎病毒(例如乙型肝炎)、疱疹病毒(例如生殖器疱疹)、轮状病毒感染、麻疹感染、腮腺炎感染、风疹感染、百日咳(百日咳)、链球菌(例如，链球菌肺炎)、大肠杆菌感染、细菌性腹泻、土拉弗朗西斯菌(例如土拉菌病)、白喉、破伤风、疟疾、炭疽、食物过敏原、桦树花粉过敏原、草花粉过敏原、猫过敏原、雪松花粉过敏原以及尘螨过敏原、豚草过敏原。[0849]醇[0850]如本文所述的醇可用于将多核糖核苷酸递送至细胞中。醇可以与如本文所述的多核糖核苷酸混合，用于将多核糖核苷酸递送至细胞中。该混合物可以包含至少约0.3％v/v至约75％v/v的醇。该醇可以是乙醇。在一些实施例中，将混合物施加至受试者的表面区域。在一些实施例中，该混合物是药物组合物。[0851]醇可以是包含一个或多个羟基官能团的任何醇。在一些情况下，醇是但不限于一元醇、多元醇、不饱和脂族醇或脂环族醇。醇可以包括以下的一种或多种：甲醇、乙醇、异丙醇、苯氧乙醇、三乙醇胺、苯乙醇、丁醇、戊醇、鲸蜡醇、乙二醇、丙二醇、变性醇、苯甲醇(特别是变性醇)、二醇、硬脂醇、鲸蜡硬脂醇、薄荷醇、聚乙二醇(peg)-400、乙氧基化脂肪酸或羟乙基纤维素。在某些实施例中，醇是乙醇。[0852]在其他情况下，本文提供的组合物、药物组合物和方法仅包括醇而不具有或不使用任何其他试剂来增强多核糖核苷酸向细胞中的递送。在一些情况下，醇是乙醇，并且组合物、药物组合物和方法不具有或不使用任何其他试剂来增强多核糖核苷酸向细胞中的递送。在一些情况下，醇是细胞穿透剂。在一些情况下，醇不是细胞穿透剂。[0853]本文披露的组合物可以包括包含醇和多核糖核苷酸的混合物。在一些情况下，多核糖核苷酸存在于与醇的预混合混合物中。在一些情况下，多核糖核苷酸在与细胞接触之前与醇分开提供。在这些情况下，多核糖核苷酸在施加至细胞时与醇接触，并混合在一起以将多核糖核苷酸递送至细胞中。不受特定理论的束缚，混合物中醇的浓度可以有助于递送效率。因此，在一些情况下，在混合物中以预定的浓度提供醇。在一些其他情况下，当醇和多核糖核苷酸最初是分开的，但当施加以用于递送时混合在一起时，醇以相对于多核糖核苷酸足够的量提供，该量将确保其在混合物中达到最小预定浓度。[0854]在一些情况下，醇占混合物的至少约0.01％、至少约0.02％、至少约0.03％、至少约0.04％、至少约0.05％、至少约0.06％、至少约0.07％、至少约0.08％、至少约0.09％、至少约0.1％、至少约0.2％、至少约0.3％、至少约0.4％、至少约0.5％、至少约0.6％、至少约0.7％、至少约0.9％、至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、或至少约98％体积比(v/v)。在一些情况下，醇占混合物的至多约0.01％、至多约0.02％、至多约0.03％、至多约0.04％、至多约0.05％、至多约0.06％、至多约0.07％、至多约0.08％、至多约0.09％、至多约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％v/v。在一些情况下，醇占混合物的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％或约100％v/v。[0855]在一些情况下，醇占混合物的至少约0.01％、至少约0.02％、至少约0.03％、至少约0.04％、至少约0.05％、至少约0.06％、至少约0.07％、至少约0.08％、至少约0.09％、至少约0.1％、至少约0.2％、至少约0.3％、至少约0.4％、至少约0.5％、至少约0.6％、至少约0.7％、至少约0.9％、至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、或至少约98％重量比(w/w)。在一些情况下，醇占混合物的至多约0.01％、至多约0.02％、至多约0.03％、至多约0.04％、至多约0.05％、至多约0.06％、至多约0.07％、至多约0.08％、至多约0.09％、至多约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％w/w。在一些情况下，细胞穿透剂占混合物的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约98％w/w。在一些情况下，醇占混合物的约10％v/v。[0856]在一些实施例中，醇占混合物的至少约0.5％v/v至约75％v/v、至少约1％v/v至约75％v/v、至少约5％v/v至约75％v/v、至少约10％v/v至约75％v/v、至少约15％v/v至约75％v/v、至少约20％v/v至约75％v/v、至少约30％v/v至约75％v/v、至少约40％v/v至约75％v/v、至少约50％v/v至约75％v/v、至少约60％v/v至约75％v/v、或至少约70％v/v至约75％v/v，或其间的任何百分比v/v。在一些实施例中，醇占混合物的至少约0.3％v/v至约70％v/v、至少约0.3％v/v至约60％v/v、至少约0.3％v/v至约50％v/v、至少约0.3％v/v至约40％v/v、至少约30％v/v至约20％v/v、至少约0.3％v/v至约15％v/v、至少约0.3％v/v至约10％v/v、至少约0.3％v/v至约5％v/v、至少约0.3％v/v至约1％v/v、或至少约0.3％v/v至约0.5％v/v，或其间的任何百分比v/v。[0857]在一些情况下，本文所述的混合物是液体溶液。例如，醇本身是液体物质。在这些情况下，多核糖核苷酸也可以溶解在液体溶液中。在一些情况下，乙醇占混合物的至少约0.1％、至少约0.2％、至少约0.3％、至少约0.4％、至少约0.5％、至少约0.6％、至少约0.7％、至少约0.9％、至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约98％体积/体积(v/v)。在一些情况下，乙醇占混合物的至多约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％v/v。在一些情况下，乙醇占混合物的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％或约100％v/v。在一些情况下，乙醇占混合物的约10％v/v。[0858]在一些实施例中，乙醇占混合物的至少约0.5％v/v至约75％v/v、至少约1％v/v至约75％v/v、至少约5％v/v至约75％v/v、至少约10％v/v至约75％v/v、至少约15％v/v至约75％v/v、至少约20％v/v至约75％v/v、至少约30％v/v至约75％v/v、至少约40％v/v至约75％v/v、至少约50％v/v至约75％v/v、至少约60％v/v至约75％v/v、或至少约70％v/v至约75％v/v，或其间的任何百分比v/v。在一些实施例中，乙醇占混合物的至少约0.3％v/v至约70％v/v、至少约0.3％v/v至约60％v/v、至少约0.3％v/v至约50％v/v、至少约0.3％v/v至约40％v/v、至少约30％v/v至约20％v/v、至少约0.3％v/v至约15％v/v、至少约0.3％v/v至约10％v/v、至少约0.3％v/v至约5％v/v、至少约0.3％v/v至约1％v/v、或至少约0.3％v/v至约0.5％v/v，或其间的任何百分比v/v。[0859]细胞穿透剂[0860]本文所述的细胞穿透剂可以包括增强多核糖核苷酸向细胞内递送的任何物质。细胞穿透剂可以包括有机化合物或无机分子。在一些情况下，细胞穿透剂是具有一个或多个官能团的有机化合物，这些官能团诸如但不限于烷烃、烯烃和芳烃；卤素取代的烷烃、烯烃和芳烃；醇、酚(苯衍生物)、醚、醛、酮和羧酸；胺和腈；以及有机硫(例如，二甲亚砜)。在一些实施例中，细胞穿透剂在极性溶剂中可溶。在一些实施例中，细胞穿透剂在极性溶剂中不可溶。多核糖核苷酸可以线性或环状形式存在。[0861]细胞穿透剂可以包括有机化合物，诸如具有一个或多个羟基官能团的醇。在一些情况下，细胞穿透剂包括醇，诸如但不限于一元醇、多元醇、不饱和脂族醇和脂环醇。细胞穿透剂可以包括以下的一种或多种：甲醇、乙醇、异丙醇、苯氧乙醇、三乙醇胺、苯乙醇、丁醇、戊醇、鲸蜡醇、乙二醇、丙二醇、变性醇、苯甲醇(特别是变性醇)、二醇、硬脂醇、鲸蜡硬脂醇、薄荷醇、聚乙二醇(peg)-400、乙氧基化脂肪酸或羟乙基纤维素。在某些实施例中，细胞穿透剂包括乙醇。[0862]在其他情况下，本文提供的组合物和方法仅包括醇作为细胞穿透剂，而没有或不使用任何其他试剂来增强多核糖核苷酸向细胞内的递送。在一些情况下，细胞穿透剂包含乙醇和任何其他可以增强多核糖核苷酸向细胞内递送的醇。在一些情况下，细胞穿透剂包含乙醇和任何其他可以增强多核糖核苷酸向细胞内递送的有机或无机分子。在一些情况下，细胞穿透剂包含乙醇和脂质体或纳米颗粒，诸如国际公开号wo2013/006825、wo2016/036735、wo2018/112282a1和wo2012/031043a1中描述的那些，这些国际公开各自通过援引以其全文并入本文。在一些情况下，细胞穿透剂包括乙醇和细胞穿透肽或蛋白，诸如以下文献中描述的那些：bechara等人,cell-penetratingpeptides:20yearslater,wheredowestand？[细胞穿透肽：20年后，我们在哪里？]febsletters[欧洲生化学会联合会快报]587(12):1693-1702(2013)；langel,cell-penetratingpeptides:processesandapplications[细胞穿透肽：过程和应用](佛罗里达州波卡拉顿crc出版社(crcpress,bocaratonfl,2002))；el-andaloussi等人，curr.pharm.des.[当今药物涉及]11(28):3597-611(2003)；deshayes等人,cell.mol.lifesci.[细胞和分子生命科学]62(16):1839-49(2005)；美国专利公开号us20130129726、us20130137644和us20130164219，其各自通过援引以其全文并入本文)。在一些情况下，乙醇与其他细胞穿透剂的比率为约1:0.001、1:0.002、1:005、1:008、1:0.01、1:0.02、1:0.05、1:0.08、1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.2、1:1.5、1:1.8、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100、1:120、1:150、1:200、1:250、1:500或1:1000。在一些情况下，乙醇与其他细胞穿透剂的比率为至少约1:0.001、1:0.002、1:005、1:008、1:0.01、1:0.02、1:0.05、1:0.08、1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.2、1:1.5、1:1.8、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100、1:120、1:150、1:200、1:250或1:500。[0863]本文披露的组合物可以包括细胞穿透剂和多核糖核苷酸的混合物。在一些情况下，多核糖核苷酸与细胞穿透剂以预混合的混合物形式存在。在一些情况下，在与细胞接触之前，将多核糖核苷酸与细胞穿透剂分开提供。在这些情况下，多核糖核苷酸在施加于细胞时与细胞穿透剂接触，并混合在一起以将多核糖核苷酸递送到细胞中。不受特定理论的束缚，混合物中细胞穿透剂的浓度可有助于递送效率。因此，在一些情况下，在混合物中以预定浓度提供细胞穿透剂。在一些其他情况下，当细胞穿透剂和多核糖核苷酸最初是分开的但在施加用于递送时混合在一起时，以相对于多核糖核苷酸，应确保其在混合物中达到最小预定浓度的足够的量提供细胞穿透剂。[0864]在一些情况下，细胞穿透剂占混合物的至少约0.01％、至少约0.02％、至少约0.03％、至少约0.04％、至少约0.05％、至少约0.06％、至少约0.07％、至少约0.08％、至少约0.09％、至少约0.1％、至少约0.2％、至少约0.3％、至少约0.4％、至少约0.5％、至少约0.6％、至少约0.7％、至少约0.9％、至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约98％体积/体积(v/v)。在一些情况下，细胞穿透剂占混合物的至多约0.01％、至多约0.02％、至多约0.03％、至多约0.04％、至多约0.05％、至多约0.06％、至多约0.07％、至多约0.08％、至多约0.09％、至多约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％v/v。在一些情况下，细胞穿透剂占混合物的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％或约100％v/v。[0865]在一些情况下，细胞穿透剂占混合物的至少约0.01％、至少约0.02％、至少约0.03％、至少约0.04％、至少约0.05％、至少约0.06％、至少约0.07％、至少约0.08％、至少约0.09％、至少约0.1％、至少约0.2％、至少约0.3％、至少约0.4％、至少约0.5％、至少约0.6％、至少约0.7％、至少约0.9％、至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约98％重量/重量(w/w)。在一些情况下，细胞穿透剂占混合物的至多约0.01％、至多约0.02％、至多约0.03％、至多约0.04％、至多约0.05％、至多约0.06％、至多约0.07％、至多约0.08％、至多约0.09％、至多约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％w/w。在一些情况下，细胞穿透剂占混合物的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约98％w/w。在一些情况下，细胞穿透剂占混合物的约10％v/v。[0866]在一些情况下，本文所述的混合物是液体溶液。例如，细胞穿透剂本身是液体物质。替代性地，细胞穿透剂是固体、液体或气体物质，并溶解在液体载剂例如水中。在这些情况下，多核糖核苷酸也可以溶解在液体溶液中。[0867]在一些情况下，乙醇占混合物的至少约0.1％、至少约0.2％、至少约0.3％、至少约0.4％、至少约0.5％、至少约0.6％、至少约0.7％、至少约0.9％、至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约98％体积/体积(v/v)。在一些情况下，乙醇占混合物的至多约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％v/v。在一些情况下，乙醇占混合物的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％或约100％v/v。在一些情况下，乙醇占混合物的约10％v/v。[0868]防腐剂[0869]本文提供的组合物或药物组合物可以包含用于单次施用的材料，或者可以包含用于多次施用的材料(例如，“多剂量”试剂盒)。多核糖核苷酸可以线性或环状形式存在。该组合物或药物组合物可以包含一种或多种防腐剂，诸如硫柳汞或2-苯氧基乙醇。防腐剂可用于防止使用过程中的微生物污染。合适的防腐剂包括：苯扎氯铵、硫柳汞、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯乙醇、依地酸二钠、山梨酸、onamerm或本领域技术人员已知的其他试剂。在眼科产品中，例如，此类防腐剂可以以0.004％至0.02％的含量采用。在本文所述的组合物中，防腐剂(例如苯扎氯铵)可以按重量计以0.001％至小于0.01％，例如0.001％至0.008％，优选约0.005％的含量采用。[0870]多核糖核苷酸可易受周围环境中可能丰富的rna酶的影响。本文提供的组合物可以包含抑制rna酶活性的试剂，从而防止多核糖核苷酸降解。在一些情况下，该组合物或药物组合物包含本领域技术人员已知的任何rna酶抑制剂。替代性地或另外，可以在无rna酶的环境中制备本文提供的组合物中的多核糖核苷酸和细胞穿透剂和/或药学上可接受的稀释剂或载剂、媒介物、赋形剂或其他试剂。该组合物可以在无rna酶的环境中配制。[0871]在一些情况下，本文提供的组合物可以是无菌的。可以在本领域已知的合适的媒介物中将组合物配制成无菌溶液或悬浮液。可以通过常规的已知灭菌技术对组合物进行灭菌，例如，可以对组合物进行无菌过滤。[0872]盐[0873]在一些情况下，本文提供的组合物或药物组合物包含一种或多种盐。为了控制张度，本文提供的组合物可以包含生理盐诸如钠盐。其他盐可以包括氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和/或氯化镁等。在一些情况下，该组合物与一种或多种药学上可接受的盐一起配制。该一种或多种药学上可接受的盐可以包括无机离子，诸如钠、钾、钙、镁离子等的那些盐。此类盐可以包括与无机酸或有机酸的盐，该无机酸或有机酸诸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、乙酸、富马酸、琥珀酸、乳酸、扁桃酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸或马来酸。多核糖核苷酸可以线性或环状形式存在。[0874]缓冲剂/ph[0875]本文提供的组合物或药物组合物可以包含一种或多种缓冲剂，诸如tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂(例如，含氢氧化铝佐剂)；或柠檬酸盐缓冲剂。在一些情况下，包含5-20mm范围内的缓冲剂。[0876]本文提供的组合物或药物组合物可以具有约5.0至约8.5、约6.0至约8.0、约6.5至约7.5、或约7.0至约7.8的ph。该组合物或药物组合物可以具有约7的ph。多核糖核苷酸可以线性或环状形式存在。[0877]洗涤剂/表面活性剂[0878]根据预期的施用途径，本文提供的组合物或药物组合物可以包含一种或多种洗涤剂和/或表面活性剂，例如聚氧乙烯山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为“吐温(tween)”)，例如聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80；以dowfaxtm商标出售的环氧乙烷(eo)、环氧丙烷(po)和/或环氧丁烷(bo)的共聚物，诸如线性eo/po嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧基-1,2-乙二基)基团的数目可以变化的辛基酚聚醚，例如辛基酚聚醚-9(tritonx-100或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(igepalca-630/np-40)；磷脂，诸如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；壬基酚聚氧乙烯醚，诸如tergitoltmnp系列；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为brij表面活性剂)，诸如三乙二醇单月桂基醚(brij30)；和脱水山梨糖醇酯(通常称为“span”)，诸如脱水山梨糖醇三油酸酯(span85)和脱水山梨糖醇单月桂酸酯、辛基酚聚醚(诸如辛基酚聚醚9(tritonx-100)或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)、十六烷基三甲基溴化铵(“ctab”)或脱氧胆酸钠。该一种或多种洗涤剂和/或表面活性剂可仅以痕量存在。在一些情况下，该组合物可以包含小于各1mg/ml的辛基酚聚醚-10和聚山梨醇酯80。在本文中可使用非离子表面活性剂。表面活性剂可以按其“hlb”(亲水/亲脂平衡值)进行分类。在一些情况下，表面活性剂的hlb为至少10、至少15和/或至少16。多核糖核苷酸可以线性或环状形式存在。[0879]稀释剂[0880]在一些实施例中，本披露的免疫原性组合物包含环状多核糖核苷酸和稀释剂。在一些实施例中，本披露的免疫原性组合物包含线性多核糖核苷酸和稀释剂。[0881]稀释剂可以是非载剂赋形剂。非载剂赋形剂用作组合物(诸如，如本文所述的环状多核糖核苷酸)的媒介物或介质。非载剂赋形剂用作组合物(诸如，如本文所述的线性多核糖核苷酸)的媒介物或介质。非载剂赋形剂的非限制性实例包括溶剂、水性溶剂、非水溶剂、分散介质、稀释剂、分散剂、助悬剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、聚合物、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶、分散剂、制粒剂、崩解剂、粘合剂、缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲盐水(pbs))、润滑剂、油及其混合物。非载剂赋形剂可以是经美国食品和药物管理局(fda)批准并列在非活性成分数据库中的不表现出细胞穿透作用的任一种非活性成分。非载剂赋形剂可以是适于施用于非人类动物(例如，适合兽医用途)的任何非活性成分。为了使组合物适于向各种动物施用，对适于向人施用的组合物的修饰得到很好的理解，并且普通技术的兽医药理师可以仅通过普通的实验(如果有)来设计和/或进行此类修饰。[0882]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以以裸递送配制品的形式递送，诸如包含稀释剂。裸递送配制品将环状多核糖核苷酸递送至细胞，无需借助于载剂并且无需对环状多核糖核苷酸、加帽的多核糖核苷酸或其复合物进行修饰或部分或完全包封。[0883]裸递送配制品是不含载剂的配制品并且其中环状多核糖核苷酸没有结合有助于递送至细胞的部分的共价修饰，或者没有对环状多核糖核苷酸的部分或完全包封。在一些实施例中，没有结合有助于递送至细胞的部分的共价修饰的环状多核糖核苷酸是未与蛋白质、小分子、颗粒、聚合物或生物聚合物共价结合的多核糖核苷酸。没有结合有助于递送至细胞的部分的共价修饰的环状多核糖核苷酸不含经修饰的磷酸基团。例如，没有结合有助于递送至细胞的部分的共价修饰的环状多核糖核苷酸不含硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼代磷酸盐、硼代磷酸酯、磷酸氢盐、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯或磷酸三酯。[0884]在一些实施例中，裸递送配制品不含以下任何或全部：转染试剂、阳离子载剂、碳水化合物载剂、纳米颗粒载剂或蛋白质载剂。在一些实施例中，裸递送配制品不含植物糖原辛烯基琥珀酸酯、植物糖原β-糊精、酸酐改性的植物糖原β-糊精、脂转染胺(lipofectamine)、聚乙烯亚胺、聚(三甲基亚胺)、聚(四甲基亚胺)、聚丙烯亚胺、氨基糖苷-聚胺、双脱氧-二氨基-b-环糊精、精胺、亚精胺、聚甲基丙烯酸(2-二甲基氨基)乙酯、聚(赖氨酸)、聚(组氨酸)、聚(精氨酸)、阳离子明胶、树状聚合物、壳聚糖、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(dotap)、n-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(dotma)、1-[2-(油酰氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羟乙基)咪唑鎓氯化物(dotim)、2,3-二油酰氧基-n-[2(精胺甲酰胺基)乙基]-n,n-二甲基-1-三氟乙酸丙铵(dospa)、3b-[n-(n,n'-二甲氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐(dc-胆固醇盐酸盐)、二-十七烷基氨基甘氨酰基亚精胺(dogs)、n,n-二硬脂基-n,n-二甲基溴化铵(ddab)、n-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-n,n-二甲基-n-羟乙基溴化铵(dmrie)、n,n-二油基-n,n-二甲基氯化铵(dodac)、人血清白蛋白(hsa)、低密度脂蛋白(ldl)、高密度脂蛋白(hdl)或球蛋白。[0885]在某些实施例中，裸递送配制品包括非载剂赋形剂。在一些实施例中，非载剂赋形剂包括不表现出细胞穿透作用的非活性成分。在一些实施例中，非载剂赋形剂包括缓冲剂，例如pbs。在一些实施例中，非载剂赋形剂是溶剂、非水溶剂、稀释剂、助悬剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、聚合物、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶、分散剂、成粒剂、崩解剂、粘合剂、缓冲剂、润滑剂或油。[0886]在一些实施例中，裸递送配制品包括稀释剂。稀释剂可以是液体稀释剂或固体稀释剂。在一些实施例中，稀释剂是rna增溶剂、缓冲剂或等渗剂。rna增溶剂的实例包括水、乙醇、甲醇、丙酮、甲酰胺和2-丙醇。缓冲剂的实例包括2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)、bis-tris、2-[(2-氨基-2-氧代乙基)-(羧甲基)氨基]乙酸(ada)、n-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸(aces)、哌嗪-n,n′‑双(2-乙磺酸)(pipes)、2-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基]氨基]乙磺酸(tes)、3-(n-吗啉代)丙烷磺酸(mops)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)、tris、tricine、gly-gly、bicine或磷酸盐。等渗剂的实例包括甘油、甘露醇、聚乙二醇、丙二醇、海藻糖或蔗糖。[0887]载剂[0888]在一些实施例中，本披露的免疫原性组合物包含环状多核糖核苷酸和载剂。在一些实施例中，本披露的免疫原性组合物包含线性多核糖核苷酸和载剂。[0889]在某些实施例中，免疫原性组合物包含在囊泡或其他基于膜的载剂中的如本文所述的环状多核糖核苷酸。在某些实施例中，免疫原性组合物包含在囊泡或其他基于膜的载剂中的如本文所述的线性多核糖核苷酸。[0890]在其他实施例中，免疫原性组合物包含在或经由细胞、囊泡或其他基于膜的载剂中的环状多核糖核苷酸。在其他实施例中，免疫原性组合物包含在或经由细胞、囊泡或其他基于膜的载剂中的线性多核糖核苷酸。在一个实施例中，免疫原性组合物包含在脂质体或其他类似囊泡中的环状多核糖核苷酸。在一个实施例中，免疫原性组合物包含在脂质体或其他类似囊泡中的线性多核糖核苷酸。脂质体是球形囊泡结构，这些球形囊泡结构由围绕内部水性隔室的单层或多层的脂质双层和相对不可渗透的外部亲脂性磷脂双层构成。脂质体可以是阴离子的、中性的或阳离子的。脂质体具有生物相容性，无毒，可以递送亲水性和亲脂性药物分子，保护其货物免受血浆酶的降解，并将其负载运输穿过生物膜和血脑屏障(bbb)(有关综述，参见，例如，spuch和navarro,journalofdrugdelivery[药物递送杂志],第2011卷,文章id469679,第12页,2011.doi:10.1155/2011/469679)。[0891]囊泡可由几种不同类型的脂质制成；然而，最常使用磷脂生成作为药物载剂的脂质体。制备多层囊泡脂质的方法是本领域已知的(参见例如美国专利号6,693,086，其关于多层囊泡脂质制备的传授内容通过援引并入文中)。尽管当脂质膜与水溶液混合时，囊泡形成可以是自发的，但也可以通过经由使用均质器、超声波仪或挤压设备以振荡的形式施加力来加快囊泡形成(关于综述，参见例如，spuch和navarro,journalofdrugdelivery[药物递送杂志],第2011卷,文章id469679,第12页,2011.doi:10.1155/2011/469679)。可通过挤出通过具有减小尺寸的过滤器来制备挤出的脂质，如templeton等人,naturebiotech[自然生物技术],15:647-652,1997中所述，其关于挤出脂质制备的传授内容通过援引并入文中。[0892]在某些实施例中，本披露的免疫原性组合物包含环状多核糖核苷酸和脂质纳米颗粒，例如本文所述的脂质纳米颗粒。在某些实施例中，本披露的免疫原性组合物包含线性多核糖核苷酸和脂质纳米颗粒。脂质纳米颗粒是为如本文所述的环状多核糖核苷酸分子提供生物相容性和可生物降解的递送系统的载剂的另一个实例。脂质纳米颗粒是为如本文所述的线性多核糖核苷酸分子提供生物相容性和可生物降解的递送系统的载剂的另一个实例。纳米结构化的脂质载剂(nlc)是经修饰的固体脂质纳米颗粒(sln)，其保留了sln的特性，提高了药物的稳定性和载药量，并防止了药物泄漏。聚合物纳米颗粒(pnp)是药物递送的重要组成部分。这些纳米颗粒可以有效地将药物递送引导至特定靶并改善药物稳定性和受控的药物释放。也可以使用脂质聚合物纳米颗粒(pln)，其是一种组合了脂质体和聚合物的新型载剂。这些纳米颗粒具有pnp和脂质体的互补优势。pln由核-壳结构构成；聚合物核提供了稳定的结构，磷脂壳提供了良好的生物相容性。这样，这两种组分提高了药物包封有效率，促进了表面修饰，并防止了水溶性药物的泄漏。有关综述，参见例如，li等人2017,nanomaterials[纳米材料]7,122；doi:10.3390/nano7060122。[0893]载剂的其他非限制性实例包括碳水化合物载剂(例如，酸酐改性的植物糖原或糖原型材料)、蛋白质载剂(例如，与环状多核糖核苷酸共价连接的蛋白质或与线性多核糖核苷酸共价连接的蛋白质)或阳离子载剂(例如，阳离子脂聚合物或转染试剂)。碳水化合物载剂的非限制性实例包括植物糖原辛烯基琥珀酸酯、植物糖原β-糊精和酸酐改性的植物糖原β-糊精。阳离子载剂的非限制性实例包括脂转染胺(lipofectamine)、聚乙烯亚胺、聚(三甲基亚胺)、聚(四甲基亚胺)、聚丙烯亚胺、氨基糖苷-聚胺、双脱氧-二氨基-b-环糊精、精胺、亚精胺、聚甲基丙烯酸(2-二甲基氨基)乙酯、聚(赖氨酸)、聚(组氨酸)、聚(精氨酸)、阳离子明胶、树状聚合物、壳聚糖、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(dotap)、n-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(dotma)、1-[2-(油酰氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羟乙基)咪唑鎓氯化物(dotim)、2,3-二油酰氧基-n-[2(精胺甲酰胺基)乙基]-n,n-二甲基-1-三氟乙酸丙铵(dospa)、3b-[n-(n,n'-二甲氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐(dc-胆固醇盐酸盐)、二-十七烷基氨基甘氨酰基亚精胺(dogs)、n,n-二硬脂基-n,n-二甲基溴化铵(ddab)、n-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-n,n-二甲基-n-羟乙基溴化铵(dmrie)和n,n-二油基-n,n-二甲基氯化铵(dodac)。蛋白质载剂的非限制性实例包括人血清白蛋白(hsa)、低密度脂蛋白(ldl)、高密度脂蛋白(hdl)或球蛋白。[0894]外来体也可用作本文所述的环状rna组合物或制剂的药物递送媒介物。外来体可用作本文所述的线性多核糖核苷酸组合物或制剂的药物递送媒介物。有关综述，参见ha等人2016年7月.actapharmaceuticasinicab.[药学学报]第6卷,第4期,第287-296页；https://doi.org/10.1016/j.apsb.2016.02.001。[0895]离体分化的红细胞也可以用作本文所述的环状rna组合物或制剂的载剂。离体分化的红细胞也可用作本文所述的线性多核糖核苷酸组合物或制剂的载剂。参见，例如，国际专利公开号wo2015/073587；wo2017/123646；wo2017/123644；wo2018/102740；wo2016/183482；wo2015/153102；wo2018/151829；wo2018/009838；shi等人2014.procnatlacadsciusa[美国国家科学院院刊].111(28):10131-10136；美国专利9,644,180；huang等人2017.naturecommunications[自然通讯]8:423；shi等人2014.procnatlacadsciusa[美国国家科学院院刊].111(28):10131-10136。[0896]例如国际专利公开号wo2018/208728中所述的融合体组合物也可以用作载剂递送本文所述的环状多核糖核苷酸分子。例如wo2018/208728中所述的融合体组合物也可以用作载剂递送本文所述的线性多核糖核苷酸分子。[0897]病毒体和病毒样颗粒(vlp)也可用作载剂将本文所述的环状多核糖核苷酸分子递送至靶向的细胞。病毒体和病毒样颗粒(vlp)也可用作载剂将本文所述的线性多核糖核苷酸分子递送至靶向的细胞。[0898]例如国际专利公开号wo2011/097480、wo2013/070324、wo2017/004526或wo2020/041784中所述的植物纳米囊泡和植物信使包(pmp)也可用作载剂递送本文所述的环状rna组合物或制剂。植物纳米囊泡和植物信使包(pmp)也可用作载剂递送本文所述的线性多核糖核苷酸组合物或制剂。[0899]微泡也可以用作载剂递送本文所述的环状多核糖核苷酸分子。微泡也可用作载剂递送本文所述的线性多核糖核苷酸分子。参见，例如，us7115583；beeri,r.等人，circulation.[循环]2002年10月1日；106(14):1756-1759；bez,m.等人，natprotoc.[自然实验手册]2019年4月；14(4):1015-1026；hernot,s.等人，advdrugdelivrev.[高级药物递送综述]2008年6月30日；60(10):1153-1166；rychak,j.j.等人，advdrugdelivrev.[高级药物递送综述]2014年6月；72:82-93。在一些实施例中，微泡是白蛋白包被的全氟化碳微泡。[0900]包含本文所述的环状多核糖核苷酸的载剂可以包含多个颗粒。这些颗粒可具有30至700纳米的中值粒度(例如30至50、50至100、100至200、200至300、300至400、400至500、500至600、600至700、100至500、50至500或200至700纳米)。可以优化颗粒的大小以有利于包括环状多核糖核苷酸在内的有效载荷沉积到细胞中。环状多核糖核苷酸沉积到某些细胞类型中可有利于不同的粒度。例如，可以优化粒度以使环状多核糖核苷酸沉积到抗原呈递细胞中。可以优化粒度以使环状多核糖核苷酸沉积到树突细胞中。另外，可以优化粒度以使环状多核糖核苷酸沉积到引流淋巴结细胞中。[0901]脂质纳米颗粒[0902]本披露提供的组合物、方法和递送系统可以采用本文所述的任何合适的载剂或递送形式，在某些实施例中包括脂质纳米颗粒(lnp)。在一些实施例中，脂质纳米颗粒包含一种或多种离子脂质，诸如非阳离子脂质(例如，中性或阴离子或两性离子脂质)；一种或多种缀合的脂质(诸如wo2019217941的表5中描述的peg缀合的脂质或缀合至聚合物的脂质；其通过援引以其全文并入本文)；一种或多种固醇(例如，胆固醇)。[0903]可用于形成纳米颗粒的脂质(例如，脂质纳米颗粒)包括例如wo2019217941的表4中描述的那些，其通过援引并入本文-例如，含脂质的纳米颗粒可包含wo2019217941的表4中的一种或多种脂质。脂质纳米颗粒可以包括另外的要素，诸如聚合物，诸如通过援引并入的wo2019217941的表5中描述的聚合物。[0904]在一些实施例中，缀合的脂质，当存在时，可以包括以下的一种或多种：peg-二酰基甘油(dag)(诸如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(peg-dmg))、peg-二烷氧基丙基(daa)、peg-磷脂、peg-神经酰胺(cer)、聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(peg-pe)、peg琥珀酸二酰基甘油(pegs-dag)(诸如4-o-(2',3'-二(十四烷酰氧基)丙基-1-o-(w-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(peg-s-dmg))、peg二烷氧基丙基氨基甲酸酯、n-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐，以及在wo2019051289的表2中描述的那些(通过援引并入)和前述的组合。[0905]在一些实施例中，可掺入脂质纳米颗粒中的固醇包括胆固醇或胆固醇衍生物中的一种或多种，诸如通过援引并入的wo2009/127060或us2010/0130588中的那些。另外的示例性固醇包括植物固醇，包括通过援引并入本文的eygeris等人(2020)，dx.doi.org/10.1021/acs.nanolett.0c01386中描述的那些。[0906]在一些实施例中，脂质颗粒包含可电离脂质、非阳离子脂质、抑制颗粒聚集的缀合脂质和固醇。这些组分的量可以独立地变化，以获得所需特性。例如，在一些实施例中，脂质纳米颗粒包含：可电离脂质，其量为总脂质的约20摩尔％至约90摩尔％(在其他实施例中，其可为脂质纳米颗粒中存在的总脂质的20％-70％(摩尔)、30％-60％(摩尔)或40％-50％(摩尔)；约50摩尔％至约90摩尔％)；非阳离子脂质，其量为总脂质的约5摩尔％至约30摩尔％；缀合脂质，其量为总脂质的约0.5摩尔％至约20摩尔％；以及固醇，其量为总脂质的约20摩尔％至约50摩尔％。总脂质与核酸的比率可以根据需要变化。例如，总脂质与核酸(质量或重量)的比率可为约10:1至约30:1。[0907]在一些实施例中，脂质与核酸的比率(质量/质量比率；w/w比)可处于约1:1至约25:1、约10:1至约14:1、约3:1至约15:1、约4:1至约10:1、约5:1至约9:1或约6:1至约9:1的范围内。可以调节脂质和核酸的量以提供所需的n/p比，例如3、4、5、6、7、8、9、10或更高的n/p比。通常，脂质纳米颗粒配制品的总脂质含量可在约5mg/ml至约30mg/ml的范围内。[0908]可用于(例如，与其他脂质组分组合)形成用于递送本文所述的组合物，例如本文所述的核酸(例如，rna(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸))的脂质纳米颗粒的脂质化合物的一些非限制性实例包括：[0909][0910]在一些实施例中，包含式(i)的lnp用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。[0911][0912]在一些实施例中，包含式(ii)的lnp用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。[0913][0914]在一些实施例中，包含式(iii)的lnp用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。[0915][0916]在一些实施例中，包含式(v)的lnp用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。元环，或x1是nr1，r1和r2与它们所附接的氮原子一起形成5-元或6-元环，或r2与r3和它们所附接的氮原子一起形成5-元、6-元或7-元环，y1是c2-12亚烷基，y2选自[0926][0927]n为0至3，r4为c1-15烷基，z1为c1-6亚烷基或直接键，[0928]z2为[0929](在任一取向上)或不存在，条件是如果z1是直接键，则z2不存在；[0930]r5是c5-9烷基或c6-10烷氧基，r6是c5-9烷基或c6-10烷氧基，w是亚甲基或直接键，并且r7是h或me，或其盐，条件是如果r3和r2是c2烷基，x1是o，x2是直链c3亚烷基，x3是c(＝0)，y1是直链ce亚烷基，(y2)n-r4是[0931][0932]r4是直链c5烷基，z1是c2亚烷基，z2不存在，w是亚甲基，并且r7是h，则r5和r6不是cx烷氧基。[0933]在一些实施例中，包含式(xii)的lnp用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。[0934][0935]在一些实施例中，包含式(xi)的lnp用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。[0936]其中[0937]在一些实施例中，lnp包含式(xiii)的化合物和式(xiv)的化合物。[0938][0939]在一些实施例中，包含式(xv)的lnp用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。[0940][0941]在一些实施例中，包含式(xvi)的配制品的lnp用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。[0942][0943]在一些实施例中，用于形成用于递送本文所述的组合物，例如本文所述的核酸(例如，rna(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸))的脂质纳米颗粒的脂质化合物通过以下反应之一制成：[0944][0945][0946]在一些实施例中，包含式(xxi)的lnp用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。在一些实施例中，式(xxi)的lnp是wo2021113777描述的lnp(例如，式(1)的脂质，诸如wo2021113777的表1的脂质)。[0947][0948]其中[0949]每个n独立地是2-15的整数；l1和l3各自独立地是-oc(o)-*或-c(o)o-*，其中“*”表示与r1或r3的附接点；[0950]r1和r3各自独立地是直链或支链c9-c20烷基或c9-c20烯基，任选地被一个或多个选自由以下组成的组的取代基取代：氧代、卤代、羟基、氰基、烷基、烯基、醛、杂环基烷基、羟基烷基、二羟基烷基、羟基烷基氨基烷基、氨基烷基、烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基、(杂环基)(烷基)氨基烷基、杂环基、杂芳基、烷基杂芳基、炔基、烷氧基、氨基、二烷基氨基、氨基烷基羰基氨基、氨基羰基烷基氨基、(氨基羰基烷基)(烷基)氨基、烯基羰基氨基、羟基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、氨基烷基氨基羰基、烷基氨基烷基氨基羰基、二烷基氨基烷基氨基羰基、杂环基烷基氨基羰基、(烷基氨基烷基)(烷基)氨基羰基、烷基氨基烷基羰基、二烷基氨基烷基羰基、杂环基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亚砜、烷基亚砜烷基、烷基磺酰基和烷基砜烷基；以及[0951]r2选自由以下组成的组：[0952][0953]在一些实施例中，包含式(xxii)的lnp用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。在一些实施例中，式(xxii)的lnp是wo2021113777描述的lnp(例如，式(2)的脂质，诸如wo2021113777的表2的脂质)。[0954][0955]其中[0956]每个n独立地是1-15的整数；[0957]r1和r2各自独立地选自由以下组成的组：[0958][0959]r3选自由以下组成的组：[0960][0961]在一些实施例中，包含式(xxiii)的lnp用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。在一些实施例中，式(xxiii)的lnp是wo2021113777描述的lnp(例如，式(3)的脂质，诸如wo2021113777的表3的脂质)。[0962][0963]其中[0964]x选自-o-、-s-或-oc(o)-*，其中*表示与r1的附接点；[0965]r1选自由以下组成的组：[0966][0967]且r2选自由以下组成的组：[0968][0969]在一些实施例中，在包含可电离脂质的lnp中提供了本文所述的组合物(例如，核酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)或蛋白质)。在一些实施例中，可电离脂质是十七烷-9-基8-((2-羟乙基)(6-氧代-6-(十一烷氧基)己基)氨基)辛酸酯(sm-102)；例如，如us9,867,888(通过援引以其全文并入本文)的实例1中所述。在一些实施例中，可电离脂质是9z,12z)-3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八碳-9,12-二烯酸酯(lp01)，例如，如wo2015/095340(通过援引以其全文并入本文)的实例13中合成的。在一些实施例中，可电离脂质是9-((4-二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((z)-壬-2-烯-1-基)酯(l319)，例如如us2012/0027803(通过援引以其全文并入本文)的实例7、实例8或实例9中合成的。在一些实施例中，可电离脂质是1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇)(c12-200)，例如，如wo2010/053572(通过援引以其全文并入本文)的实例14和实例16中合成的。在一些实施例中，可电离脂质是咪唑胆固醇酯(ice)脂质(3s,10r,13r,17r)-10,13-二甲基-17-((r)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1h-环戊烯并[a]菲-3-基3-(1h-咪唑-4-基)丙酸酯，例如来自wo2020/106946(通过援引以其全文并入本文)的结构(i)。[0970]在一些实施例中，可电离脂质可以是阳离子脂质、可电离阳离子脂质，例如可以根据ph以带正电荷的形式或中性形式存在的阳离子脂质，或可以容易地质子化的含胺脂质。在一些实施例中，阳离子脂质是例如在生理条件下能够带正电的脂质。示例性的阳离子脂质包括一个或多个带有正电荷的胺基。在一些实施例中，脂质颗粒包含与中性脂质、可电离含胺脂质、可生物降解的炔脂质、类固醇、包括多不饱和脂质的磷脂、结构脂质(例如固醇)、peg、胆固醇和聚合物缀合脂质中的一种或多种配制的阳离子脂质。在一些实施例中，阳离子脂质可以是可电离的阳离子脂质。如本文所披露的示例性阳离子脂质可具有超过6.0的有效pka。在实施例中，脂质纳米颗粒可包含具有与第一阳离子脂质不同的有效pka(例如，大于第一有效pka)的第二阳离子脂质。脂质纳米颗粒可包含40摩尔％至60摩尔％的包封在脂质纳米颗粒内或与脂质纳米颗粒缔合的阳离子脂质、中性脂质、类固醇、聚合物缀合的脂质和治疗剂，例如本文所述的核酸(例如rna(例如环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸))。在一些实施例中，核酸与阳离子脂质共同配制。核酸可以吸附到lnp(例如包含阳离子脂质的lnp)的表面。在一些实施例中，核酸可以包封在lnp(例如包含阳离子脂质的lnp)中。在一些实施例中，脂质纳米颗粒可包含靶向部分，例如用靶向剂包被的靶向部分。在实施例中，lnp配制品是生物可降解的。在一些实施例中，包含一种或多种本文所述的脂质(例如式(i)、(ii)、(ii)、(vii)和/或(ix))的脂质纳米颗粒包封至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％或100％的rna分子。[0971]可用于脂质纳米颗粒配制品中的示例性可电离脂质包括但不限于通过援引并入本文的wo2019051289的表1中所列的那些。另外的示例性脂质包括但不限于下式中的一种或多种：us2016/0311759的x；us20150376115或us2016/0376224中的i；us20160151284的i、ii或iii；us20170210967的i、ia、ii或iia；us20150140070的i-c；us2013/0178541的a；us2013/0303587或us2013/0123338的i；us2015/0141678的i；us2015/0239926的ii、iii、iv或v；us2017/0119904的i；wo2017/117528的i或ii；us2012/0149894的a；us2015/0057373的a；wo2013/116126的a；us2013/0090372的a；us2013/0274523的a；us2013/0274504的a；us2013/0053572的a；wo2013/016058的a；wo2012/162210的a；us2008/042973的i；us2012/01287670的i、ii、iii或iv；us2014/0200257的i或ii；us2015/0203446的i、ii或iii；us2015/0005363的i或iii；us2014/0308304的i、ia、ib、ic、id、ii、iia、iib、iic、iid或iii-xxiv；us2013/0338210；wo2009/132131的i、ii、iii或iv；us2012/01011478的a；us2012/0027796的i或xxxv；us2012/0058144的xiv或xvii；us2013/0323269；us2011/0117125的i；us2011/0256175的i、ii或iii；us2012/0202871的i、ii、iii、iv、v、vi、vii、viii、ix、x、xi、xii；us2011/0076335的i、ii、iii、iv、v、vi、vii、viii、x、xii、xiii、xiv、xv或xvi；us2006/008378的i或ii；us2013/0123338的i；us2015/0064242的i或x-a-y-z；us2013/0022649的xvi、xvii或xviii；us2013/0116307的i、ii或iii；us2013/0116307的i、ii或iii；us2010/0062967的i或ii；us2013/0189351的i-x；us2014/0039032的i；us2018/0028664的v；us2016/0317458的i；us2013/0195920的i；us10,221,127的5、6或10；wo2018/081480的iii-3；wo2020/081938的i-5或i-8；us9,867,888的18或25；us2019/0136231的a；wo2020/219876的ii；us2012/0027803的1；us2019/0240349的of-02；us10,086,013的23；miao等人(2020)的ckk-e12/a6；wo2010/053572的c12-200；dahlman等人(2017)的7c1；whitehead等人的304-o13或503-o13；us9,708,628的ts-p4c2；wo2020/106946的i；wo2020/106946的i；和wo2021/113777的(1)、(2)、(3)或(4)。示例性脂质还包括wo2021/113777的表1-16中任一个的脂质。[0972]在一些实施例中，可电离脂质是mc3(6z,9z,28z,31z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(dlin-mc3-dma或mc3)，例如，如wo2019051289a9(通过援引以其全文并入本文)的实例9中所述。在一些实施例中，可电离脂质是脂质atx-002，例如，如wo2019051289a9(通过援引以其全文并入本文)的实例10中所述。在一些实施例中，可电离脂质是(13z,16z)-a,a-二甲基-3-壬基二十二-13,16-二烯-1-胺(化合物32)，例如，如wo2019051289a9(通过援引以其全文并入本文)的实例11中所述。在一些实施例中，可电离脂质是化合物6或化合物22，例如，如wo2019051289a9(通过援引以其全文并入本文)的实例12中所述。[0973]示例性非阳离子脂质包括但不限于二硬脂酰-sn-甘油基-磷酸乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、二油酰磷脂酰胆碱(dopc)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、二油酰磷脂酰胆碱(dopg)、二棕榈酰磷脂酰甘油(dppg)、二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(popc)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(pope)、二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(n-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(dope-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(dppe)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(dmpe)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(dspe)、单甲基-磷脂酰乙醇胺(诸如16-o-单甲基pe)、二甲基-磷脂酰乙醇胺(诸如16-o-二甲基pe)、18-1-反式pe、1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(sope)、氢化大豆磷脂酰胆碱(hspc)、卵磷脂酰胆碱(epc)、二油酰磷脂酰丝氨酸(dops)、神经鞘磷脂(sm)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(dmpc)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(dmpg)、二硬脂酰磷脂酰甘油(dspg)、二芥酰基磷脂酰胆碱(depc)、棕榈酰油酰磷脂酰甘油(popg)、二反油烯酰-磷脂酰乙醇胺(depe)、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、卵鞘磷脂(esm)、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷脂、双十六烷基磷酸、溶血磷脂酰胆碱、二亚油酰基磷脂酰胆碱或其混合物。应当理解，也可以使用其他二酰基磷脂酰胆碱和二酰基磷脂酰乙醇胺磷脂。这些脂质中的酰基基团优选为衍生自具有c10-c24碳链的脂肪酸的酰基基团，例如月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基或油酰基。在某些实施例中，另外的示例性脂质包括但不限于通过援引并入本文的kim等人(2020)dx.doi.org/10.1021/acs.nanolett.0c01386描述的那些。在一些实施例中，此类脂质包括发现会改善用mrna进行肝转染的植物脂质(例如dgts)。[0974]适合用于脂质纳米颗粒中的非阳离子脂质的其他实例包括但不限于非磷脂质，例如硬脂胺、十二烷基胺、十六烷基胺、乙酰基棕榈酸酯、蓖麻酸甘油酯、硬脂酸十六烷基酯、肉豆蔻酸异丙酯、两性丙烯酸聚合物、三乙醇胺-月桂基硫酸盐、烷基-芳基硫酸盐、聚乙氧基化脂肪酸酰胺、双十八烷基二甲基溴化铵、神经酰胺、鞘磷脂等。其他非阳离子脂质在wo2017/099823或美国专利公开us2018/0028664中有描述，其内容通过援引以其全文并入本文。[0975]在一些实施例中，非阳离子脂质是油酸或通过援引以其全文并入的us2018/0028664的式i、ii或iv的化合物。非阳离子脂质可以占脂质纳米颗粒中存在的总脂质的例如0％-30％(摩尔)。在一些实施例中，非阳离子脂质含量是脂质纳米颗粒中存在的总脂质的5％-20％(摩尔)或10％-15％(摩尔)。在实施例中，可电离脂质与中性脂质的摩尔比为约2:1至约8:1(例如，约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1或8:1)。[0976]在一些实施例中，脂质纳米颗粒不包含任何磷脂。[0977]在一些方面，脂质纳米颗粒可进一步包含诸如固醇的组分以提供膜完整性。可用于脂质纳米颗粒中的一种示例性固醇是胆固醇及其衍生物。胆固醇衍生物的非限制性实例包括极性类似物，诸如5a-胆甾烷醇、53-粪甾烷醇、胆甾醇基-(2,-羟基)-乙基醚、胆甾醇基-(4'-羟基)-丁基醚和6-酮胆甾烷醇；非极性类似物，诸如5a-胆甾烷、胆甾烯酮、5a-胆甾烷酮、5p-胆甾烷酮和胆甾醇癸酸酯；及其混合物。在一些实施例中，胆固醇衍生物是极性类似物，例如，胆甾醇基-(4'-羟基)-丁基醚。示例性的胆固醇衍生物在pct公开wo2009/127060和美国专利公开us2010/0130588中有描述，其各自通过援引以其全文并入本文。[0978]在一些实施例中，提供膜完整性的组分，诸如固醇，可占脂质纳米颗粒中存在的总脂质的0％-50％(摩尔)(例如，0％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％或40％-50％)。在一些实施例中，此类组分是脂质纳米颗粒的总脂质含量的20％-50％(摩尔)、30％-40％(摩尔)。[0979]在一些实施例中，脂质纳米颗粒可包含聚乙二醇(peg)或缀合的脂质分子。通常，这些用于抑制脂质纳米颗粒的聚集和/或提供空间稳定。示例性的缀合脂质包括但不限于peg-脂质缀合物、聚噁唑啉(poz)-脂质缀合物、聚酰胺-脂质缀合物(诸如atta-脂质缀合物)、阳离子聚合物脂质(cpl)缀合物及其混合物。在一些实施例中，缀合脂质分子是peg-脂质缀合物，例如(甲氧基聚乙二醇)缀合脂质。[0980]示例性的peg-脂质缀合物包括但不限于peg-二酰基甘油(dag)(诸如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(peg-dmg))、peg-二烷氧基丙基(daa)、peg-磷脂、peg-神经酰胺(cer)、聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(peg-pe)、peg琥珀酸二酰基甘油(pegs-dag)(诸如4-o-(2',3'-二(十四烷酰氧基)丙基-1-o-(w-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(peg-s-dmg))、peg二烷氧基丙基氨基甲酸酯、n-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐或其混合物。另外的示例性peg-脂质缀合物例如在us5,885,6l3、us6,287,59l、us2003/0077829、us2003/0077829、us2005/0175682、us2008/0020058、us2011/0117125、us2010/0130588、us2016/0376224、us2017/0119904和us/099823中有描述，所有这些的内容通过援引以其全文并入本文。在一些实施例中，peg-脂质是us2018/0028664的式iii、iii-a-i、iii-a-2、iii-b-1、iii-b-2或v的化合物，其内容通过援引以其全文并入本文。在一些实施例中，peg-脂质具有us20150376115或us2016/0376224的式ii，两者的内容通过援引以其全文并入本文。在一些实施例中，peg-daa缀合物可以是例如peg-二月桂基氧基丙基、peg-二肉豆蔻基氧基丙基、peg-二棕榈基氧基丙基或peg-二硬脂基氧基丙基。peg-脂质可以是以下的一种或多种：peg-dmg、peg-二月桂基甘油、peg-二棕榈酰甘油、peg-二硬脂基甘油、peg-二月桂基甘油脂酰胺、peg-二肉豆蔻基甘油脂酰胺、peg-二棕榈酰甘油脂酰胺、peg-二硬脂基甘油脂酰胺、peg-胆固醇(1-[8'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰胺基-3',6'-二氧杂辛基]氨基甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)、peg-dmb(3,4-双十四烷氧基苄基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)和1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。在一些实施例中，peg-脂质包含peg-dmg、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。在一些实施例中，peg-脂质包含选自以下的结构：[0981][0982]在一些实施例中，与peg以外的分子缀合的脂质也可用于代替peg-脂质。例如，聚噁唑啉(poz)-脂质缀合物、聚酰胺-脂质缀合物(诸如atta-脂质缀合物)和阳离子聚合物脂质(gpl)缀合物可用于代替peg-脂质或与peg-脂质一起使用。[0983]示例性的缀合脂质，即peg-脂质、(poz)-脂质缀合物、atta-脂质缀合物和阳离子聚合物-脂质在wo2019051289a9的表2中列出的pct和lis专利申请中有描述，其全部的内容通过援引以其全文并入本文。[0984]在一些实施例中，peg或缀合脂质可以占脂质纳米颗粒中存在的总脂质的0％-20％(摩尔)。在一些实施例中，peg或缀合脂质的含量为脂质纳米颗粒中存在的总脂质的0.5％-10％或2％-5％(摩尔)。可电离脂质、非阳离子脂质、固醇和peg/缀合脂质的摩尔比可以根据需要变化。例如，脂质颗粒可包含按组合物的摩尔或总重量计30％-70％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计0％-60％的胆固醇，按组合物的摩尔或总重量计0％-30％的非阳离子脂质和按组合物的摩尔或总重量计1％-10％的缀合脂质。优选地，组合物包含按组合物的摩尔或总重量计30％-40％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计40％-50％的胆固醇，和按组合物的摩尔或总重量计10％-20％的非阳离子脂质。在一些其他实施例中，该组合物是按组合物的摩尔或总重量计50％-75％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计20％-40％的胆固醇和按组合物的摩尔或总重量计5％至10％的非阳离子脂质以及按组合物的摩尔或总重量计1％-10％的缀合脂质。该组合物可以含有按组合物的摩尔或总重量计60％-70％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计25％-35％的胆固醇，以及按组合物的摩尔或总重量计5％-10％的非阳离子脂质。该组合物还可含有按组合物的摩尔或总重量计至多90％的可电离脂质和按组合物的摩尔或总重量计2％至15％的非阳离子脂质。配制品也可以是脂质纳米颗粒配制品，例如包含按组合物的摩尔或总重量计8％-30％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计5％-30％的非阳离子脂质，以及按组合物的摩尔或总重量计0％-20％的胆固醇；按组合物的摩尔或总重量计4％-25％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计4％-25％的非阳离子脂质，按组合物的摩尔或总重量计2％至25％的胆固醇，按组合物的摩尔或总重量计10％至35％的缀合脂质，以及按组合物的摩尔或总重量计5％的胆固醇；或按组合物的摩尔或总重量计2％-30％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计2％-30％的非阳离子脂质，按组合物的摩尔或总重量计1％至15％的胆固醇，按组合物的摩尔或总重量计2％至35％的缀合脂质，以及按组合物的摩尔或总重量计1％-20％的胆固醇；或按组合物的摩尔或总重量计甚至高达90％的可电离脂质和按组合物的摩尔或总重量计2％-10％的非阳离子脂质，或按组合物的摩尔或总重量计甚至100％的阳离子脂质。在一些实施例中，脂质颗粒配制品包含摩尔比为50:10:38.5:1.5的可电离脂质、磷脂、胆固醇和聚乙二醇化脂质。在一些其他实施例中，脂质颗粒配制品包含摩尔比为60:38.5:1.5的可电离脂质、胆固醇和聚乙二醇化脂质。[0985]在一些实施例中，脂质颗粒包含可电离脂质、非阳离子脂质(例如磷脂)、固醇(例如胆固醇)和聚乙二醇化脂质，其中可电离脂质的脂质摩尔比在20至70摩尔％的范围内，目标为40-60，非阳离子脂质的摩尔百分比在0至30的范围内，目标为0至15，固醇的摩尔百分比在20至70的范围内，目标为30至50，并且聚乙二醇化脂质的摩尔百分比在1至6的范围内，目标为2至5。[0986]在一些实施例中，脂质颗粒包含摩尔比为50:10:38.5:1.5的可电离脂质/非阳离子脂质/固醇/缀合脂质。[0987]一方面，本披露提供了包含磷脂、卵磷脂、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的脂质纳米颗粒配制品。[0988]在一些实施例中，还可以包括一种或多种另外的化合物。那些化合物可以单独施用，或者另外的化合物可以包括在本发明的脂质纳米颗粒中。换言之，除核酸或至少第二核酸之外，脂质纳米颗粒可含有不同于第一核酸的其他化合物。非限制性地，其他另外的化合物可以选自由以下组成的组：小的或大的有机分子或无机分子、单糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、肽、蛋白质、其肽类似物和衍生物、肽模拟物、核酸、核酸类似物和衍生物、由生物材料制成的提取物，或其任何组合。[0989]在一些实施例中，lnp包含生物可降解的可电离脂质。在一些实施例中，lnp包含(9z,l2z)-3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八碳-9,l2-二烯酸酯，也称为3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基(9z,l2z)-十八碳-9,l2-二烯酸酯)或另一种可电离脂质。参见，例如wo2019/067992、wo/2017/173054、wo2015/095340和wo2014/136086，以及其中提供的参考文献的脂质。在一些实施例中，在lnp脂质的上下文中术语阳离子和可电离是可互换的，例如，其中可电离脂质根据ph是阳离子的。[0990]在一些实施例中，lnp配制品的平均lnp直径可以在数十nm和数百nm之间，例如通过动态光散射(dls)测量的。在一些实施例中，lnp配制品的平均lnp直径可以为约40nm至约150nm，诸如约40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm或150nm。在一些实施例中，lnp配制品的平均lnp直径可为约50nm至约100nm、约50nm至约90nm、约50nm至约80nm、约50nm至约70nm、约50nm至约60nm、约60nm至约100nm、约60nm至约90nm、约60nm至约80nm、约60nm至约70nm、约70nm至约100nm、约70nm至约90nm、约70nm至约80nm、约80nm至约100nm、约80nm至约90nm或约90nm至约100nm。在一些实施例中，lnp配制品的平均lnp直径可为约70nm至约100nm。在特定实施例中，lnp配制品的平均lnp直径可为约80nm。在一些实施例中，lnp配制品的平均lnp直径可为约100nm。在一些实施例中，lnp配制品的平均lnp直径范围为约1mm至约500mm、约5mm至约200mm、约10mm至约100mm、约20mm至约80mm、约25mm至约60mm、约30mm至约55mm、约35mm至约50mm，或约38mm至约42mm。[0991]在一些情况下，lnp可以是相对均质的。多分散性指数可用于指示lnp的均质性，例如脂质纳米颗粒的粒度分布。小的(例如，小于0.3)多分散性指数通常指示窄的粒度分布。lnp的多分散指数可为约0至约0.25，诸如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25。在一些实施例中，lnp的多分散指数可为约0.10至约0.20。[0992]lnp的ζ电位可用于指示组合物的电动电位。在一些实施例中，ζ电位可以描述lnp的表面电荷。具有相对低电荷(正电荷或负电荷)的脂质纳米颗粒通常是期望的，因为更高电荷的物质可能不理想地与体内的细胞、组织和其他元素相互作用。在一些实施例中，lnp的ζ电位可为约-10mv至约+20mv、约-10mv至约+15mv、约-10mv至约+10mv、约-10mv至约+5mv、约-10mv至约0mv、约-10mv至约-5mv、约-5mv至约+20mv、约-5mv至约+15mv、约-5mv至约+10mv、约-5mv至约+5mv、约-5mv至约0mv、约0mv至约+20mv、约0mv至约+15mv、约0mv至约+10mv、约0mv至约+5mv、约+5mv至约+20mv、约+5mv至约+15mv或约+5mv至约+10mv。[0993]蛋白质和/或核酸的包封效率描述了相对于所提供的初始量，在制备后被包封或以其他方式与lnp缔合的蛋白质和/或核酸的量。包封效率理想的是较高(例如，接近100％)。包封效率可以例如通过比较在用一种或多种有机溶剂或洗涤剂破碎脂质纳米颗粒之前和之后含有脂质纳米颗粒的溶液中蛋白质或核酸的量来测量。阴离子交换树脂可用于测量溶液中游离蛋白质或核酸(例如rna)的量。荧光可用于测量溶液中游离蛋白质和/或核酸(例如rna)的量。对于本文所述的脂质纳米颗粒，蛋白质和/或核酸的包封效率可以是至少50％，例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施例中，包封效率可以是至少80％。在一些实施例中，包封效率可以是至少90％。在一些实施例中，包封效率可以是至少95％。[0994]lnp可以任选地包含一层或多层包衣。在一些实施例中，lnp可以配制在具有包衣的胶囊、膜或片剂中。包含本文所述的组合物的胶囊、膜或片剂可具有任何可用的尺寸、拉伸强度、硬度或密度。[0995]另外的示例性脂质、配制品、方法和lnp表征由wo2020/061457和wo2021/113777传授，其各自通过援引以其全文并入本文。其他示例性的脂质、配制品、方法和lnp表征由hou等人lipidnanoparticlesformrnadelivery[用于mrna递送的脂质纳米颗粒].natrevmater[自然评论材料](2021).doi.org/10.1038/s41578-021-00358-0传授，其通过援引以其全文并入本文(参见例如hou等人的图2的示例性脂质和脂质衍生物)。[0996]在一些实施例中，使用lipofectaminemessengermax(赛默飞世尔(thermofisher))或transit-mrna转染试剂(米卢斯生物(mirusbio))进行体外或离体细胞脂质转染。在某些实施例中，使用genvoy_ilm可电离脂质混合物(精密纳米系统(precisionnanosystems))配制lnp。在某些实施例中，使用2,2-二亚油烯基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(dlin-kc2-dma)或二亚油烯基甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(dlin-mc3-dma或mc3)配制lnp，其配制和体内用途在jayaraman等人angewchemintedengl[德国应用化学]51(34):8529-8533(2012)中传授，通过援引以其全文并入本文。[0997]优化用于递送crispr-cas系统(例如cas9-grnarnp、grna、cas9mrna)的lnp配制品在两者均通过援引并入的wo2019067992和wo2019067910中有描述，并且可用于递送本文所述的环状多核糖核苷酸和线性多核糖核苷酸。[0998]可用于递送核酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)的另外的特定lnp配制品在两者均通过援引并入的us8158601和us8168775中有描述，其包括帕替西兰(patisiran)中使用的以名称onpattro销售的配制品。[0999]多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)lnp的示例性给药可包括约0.1、0.25、0.3、0.5、1、2、3、4、5、6、8、10或100mg/kg(rna)。包含多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)的aav的示例性给药可包括约1011、1012、1013和1014vg/kg的moi。[1000]佐剂[1001]佐剂会增强在接受佐剂和/或包含该佐剂的免疫原性组合物的受试者中引发的免疫反应(体液和/或细胞免疫反应)。在一些实施例中，如本文所披露的，将佐剂施用于受试者。在一些实施例中，佐剂用于本文所述的方法中以产生如本文所述的免疫反应。在一个特定实施例中，佐剂用于促进受试者中针对由环状多核糖核苷酸表达的免疫原的免疫反应。在一些实施例中，佐剂和多核糖核苷酸在分开的组合物中共同施用。在一些实施例中，将佐剂与多核糖核苷酸混合或配制为单一组合物，并施用于受试者。在一些实施例中，佐剂和环状或线性多核糖核苷酸在分开的组合物中共同施用。在一些实施例中，将佐剂与线性或环状多核糖核苷酸混合或配制为单一组合物以获得免疫原性组合物，将该免疫原性组合物施用于受试者。[1002]佐剂可以是环状或线性多核糖核苷酸的组分(例如，多核糖核苷酸序列)，可以是由多核糖核苷酸的表达序列编码的多肽佐剂，可以是并非由多核糖核苷酸编码的分子(例如小分子、多肽或核酸分子)。佐剂可以与多核糖核苷酸一起配制在同一药物组合物中。佐剂可以与多核糖核苷酸组合分开施用(例如，作为分开的药物组合物)。[1003]在一些实施例中，佐剂由环状或线性多核糖核苷酸编码。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸编码多于一种佐剂。例如，环状或线性多核糖核苷酸编码2至100种佐剂。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸编码2至10种佐剂。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸编码2种佐剂。由环状或线性多核糖核苷酸编码的佐剂中的一种或多种可包括n端信号序列，例如将表达的多肽佐剂引导至分泌途径的信号序列。在一些实施例中，多核糖核苷酸编码3种佐剂。在一些实施例中，多核糖核苷酸编码4种佐剂。在一些实施例中，多核糖核苷酸编码5种佐剂。在一些实施例中，佐剂由编码一种或多种免疫原的同一多核糖核苷酸编码。佐剂和免疫原可以在同一多核糖核苷酸上共同递送。在一些实施例中，由多核糖核苷酸编码的佐剂是作为先天性免疫系统刺激剂的序列(例如，多核糖核苷酸序列)。先天性免疫系统刺激剂序列可以包括至少5个、至少10个、至少20个、至少50个、至少100个或至少500个核糖核苷酸。先天性免疫系统刺激剂序列可以包括5至1000个、10至500个、20至500个、10至100个、20至100个、20至50个、100至500个、500至1000个或10至1000个核糖核苷酸。例如，作为先天性免疫系统刺激剂的序列可选自富含gu的基序、富含au的基序、包含dsrna的结构化区域、或适体。[1004]佐剂可以是th1佐剂和/或th2佐剂。本披露考虑的其他佐剂包括但不限于以下的一种或多种：[1005]含矿物质的组合物。适于在本披露中用作佐剂的含矿物质的组合物包括矿物盐，诸如铝盐和钙盐。本披露包括矿物盐，诸如氢氧化物(例如羟基氧化物)、磷酸盐(例如羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等，或不同矿物化合物的混合物，其中化合物呈任何合适的形式(例如凝胶、结晶、无定形形式等)。钙盐包括磷酸钙(例如，“cap”)。铝盐包括氢氧化物、磷酸盐、硫酸盐等。[1006]油乳剂组合物。适于在本披露中用作佐剂的油乳剂组合物包括角鲨烯-水乳剂，诸如mf59(5％角鲨烯、0.5％吐温80和0.5％span，使用微流化器配制为亚微米颗粒)、as03(水包油乳剂中的α-生育酚、角鲨烯和聚山梨醇酯80)、montanide配制品(例如montanideisa51、montanideisa720)、不完全弗氏佐剂(ifa)、完全弗氏佐剂(cfa)和不完全弗氏佐剂(ifa)。[1007]小分子。适于在本披露中用作佐剂的小分子包括咪喹莫特或847、瑞喹莫德或r848和嘎德莫特。[1008]聚合物纳米颗粒。适于在本披露中用作佐剂的聚合物纳米颗粒包括聚(a-羟基酸)、聚羟基丁酸、聚内酯(包括聚己内酯)、聚对二氧环己酮、聚戊内酯、聚原酸酯、聚酸酐、聚氰基丙烯酸酯、酪氨酸衍生的聚碳酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮或聚酯-酰胺及其组合。[1009]皂苷(即，糖苷，附接至一条或多条糖侧链的多环苷元)。适于在本披露中用作佐剂的皂苷配制品包括纯化配制品，诸如qs21，以及脂质配制品，诸如iscom和iscom基质。qs21作为stimulon(tm)在市场上销售。皂苷配制品也可以包含固醇，诸如胆固醇。皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合物(iscom)的独特颗粒。iscom通常还包含磷脂，诸如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷都可用于iscom中。优选地，iscom包含quila、qha和qhc中的一种或多种。任选地，iscom可以不含另外的洗涤剂。[1010]脂多糖。适于在本披露中使用的佐剂包括肠细菌脂多糖(lps)的无毒衍生物。此类衍生物包括单磷酰基脂质a(mpla)、吡喃葡萄糖基脂质a(gla)和3-o-去酰化mpl(3dmpl)。3dmpl是3脱氧-酰化单磷酰基脂质a与4、5或6条酰化链的混合物。其他无毒lps衍生物包括单磷酰基脂质a模拟物，诸如氨基烷基氨基葡萄糖胺磷酸盐衍生物，例如rc-529。[1011]脂质体。适于在本披露中用作佐剂的脂质体包括病毒体和caf01。[1012]脂质纳米颗粒。适于在本披露中使用的佐剂包括脂质纳米颗粒(lnp)及其组分。[1013]脂肽(即，包含一个或多个脂肪酸残基和两个或更多个氨基酸残基的化合物)。适于在本披露中用作佐剂的脂肽包括pam2(pam2csk4)和pam3(pam3csk4)。[1014]糖脂。适于在本披露中用作佐剂的糖脂包括索状因子(海藻糖二霉菌酸酯)。[1015]从革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌衍生(合成或纯化)的肽和肽聚糖，诸如mdp(n-乙酰-胞壁酰-l-丙氨酰-d-异谷氨酰胺)适于在本披露中用作佐剂。[1016]适于用作佐剂的碳水化合物(含碳水化合物)或多糖包括右旋糖酐(例如，支链微生物多糖)、硫酸右旋糖酐、香菇多糖、酵母聚糖、β-葡聚糖、deltin、甘露聚糖和几丁质。[1017]基于rna的佐剂。适于在本披露中使用的基于rna的佐剂是聚ic、聚ic:lc、带有或不带5'三磷酸的发夹rna、病毒序列、含聚u的序列、dsrna天然或合成rna序列及核酸类似物(例如，环状gmp-amp或其他环状二核苷酸(例如环状二-gmp)、免疫刺激性碱基类似物(例如c8-取代的和n7,c8-二取代的鸟嘌呤核糖核苷酸))。在一些实施例中，佐剂是本文所述的环状多核糖核苷酸的线性多核糖核苷酸对应物。[1018]基于dna的佐剂。适于在本披露中使用的基于dna的佐剂包括cpg、dsdna和天然或合成的免疫刺激dna序列。[1019]蛋白质或肽。适于在本披露中用作佐剂的蛋白质和肽包括鞭毛蛋白融合蛋白、mbl(甘露糖结合凝集素)、细胞因子和趋化因子。[1020]病毒颗粒。适于用作佐剂的病毒颗粒包括病毒体(磷脂细胞膜双层)。[1021]在本披露中使用的佐剂可以是细菌来源的，诸如鞭毛蛋白、lps或细菌毒素(例如肠毒素(蛋白质)，例如热不稳定毒素或霍乱毒素)。在本披露中使用的佐剂可以是杂交分子，诸如缀合至咪喹莫特的cpg。在本披露中使用的佐剂可以是真菌或与卵菌微生物相关分子模式(mamp)，诸如几丁质或β-葡聚糖。在一些实施例中，佐剂是无机纳米颗粒，诸如金纳米棒或基于二氧化硅的纳米颗粒(例如介孔二氧化硅纳米颗粒(msn))。在一些实施例中，佐剂是用糖脂免疫调节剂(海藻糖6,6-二山嵛酸酯(tdb)，这可以是位于分枝杆菌细胞壁上的索状因子的合成变体)稳定的多组分佐剂或佐剂系统，诸如as01、as03、as04(mlp5+明矾)、cfa(完全弗氏佐剂：ifa+肽聚糖+海藻糖二霉菌酸酯)、caf01(阳离子脂质体媒介物的两组分系统(二甲基双十八烷基铵(dda))。[1022]细胞因子。佐剂可以是编码细胞因子的部分或全长dna，该细胞因子诸如促炎性细胞因子(例如，gm-csf、il-1α、il-1β、tgf-β、tnf-α、tnf-β)、th-1诱导细胞因子(例如，ifn-γ、il-2、il-12、il-15、il-18)或th-2诱导细胞因子(例如，il-4、il-5、il-6、il-10、il-13)。[1023]趋化因子。佐剂可以是编码趋化因子的部分或全长dna或rna(例如，circrna或mrna)，趋化因子诸如mcp-1、mip-1α、mip-1β、rantes或tca-3。[1024]佐剂可以是编码共刺激分子的部分或全长dna，共刺激分子诸如cd80、cd86、cd40-l、cd70或cd27。[1025]佐剂可以是编码以下的部分或全长dna或rna(例如circrna或mrna)：先天性免疫系统刺激剂(部分、全长或突变的)诸如tlr4、tlr3、tlr3、tlr9、tlr7、tlr8、tlr7、rig-i/ddx58或mda-5/ifih1；或组成型活性(ca)先天性免疫刺激因子，诸如catlr4、catlr3、catlr3、catlr9、catlr7、catlr8、catlr7、carig-i/ddx58或camda-5/ifih1。[1026]佐剂可以是编码适体或信号传导分子的部分或全长dna或rna(例如circrna或mrna)，该适体或信号传导分子诸如sting(例如casting)、trif、tram、myd88、ips1、asc、mavs、mapk、ikk-α、ikk复合物、tbk1、β-连环蛋白和半胱天冬酶1。[1027]佐剂可以是编码转录激活因子的部分或全长dna或rna(例如circrna或mrna)，该转录激活因子诸如可以上调免疫反应的转录激活因子(例如，ap1、nf-κb、irf3、irf7、irf1或irf5)。佐剂可以是编码细胞因子受体诸如il-2β、ifn-γ或il-6的部分或全长dna。[1028]佐剂可以是编码细菌组分诸如鞭毛蛋白或mbl的部分或全长dna或rna(例如circrna或mrna)。[1029]佐剂可以是编码先天性免疫系统的任何组分的部分或全长dna或rna(例如circrna或mrna)。[1030]在一些实施例中，将编码一种或多种免疫原的环状或线性多核糖核苷酸与佐剂(例如，作为与环状多核糖核苷酸分开的分子实体的佐剂或在分开的多核糖核苷酸上编码的佐剂)组合施用给受试者。如说明书全篇使用的术语“与......组合”包括作为治疗方案的一部分施用的任何两种组合物。这可以包括例如配制成单一药物组合物的多核糖核苷酸和佐剂。这还包括，例如，根据限定的治疗或给药方案，作为分开的组合物施用给受试者的多核糖核苷酸和佐剂。佐剂可以在多核糖核苷酸施用之前、基本上同时或之后施用给受试者。佐剂可以在多核糖核苷酸施用之前或之后的1天、2天、5天、10天、20天、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月内施用。佐剂可以通过与多核糖核苷酸相同的施用途径(例如，肌内、皮下、静脉内、腹膜内、局部或口服)或不同的途径来施用。[1031]疫苗[1032]在本文所述的方法的一些实施例中，还向受试者施用第二试剂，例如，还向受试者施用第二疫苗。在一些实施例中，施用于受试者的组合物包含本文所述的环状多核糖核苷酸和第二疫苗。在一些实施例中，疫苗和环状多核糖核苷酸在分开的组合物中共同施用。该疫苗与环状多核糖核苷酸免疫接种同时施用，在环状多核糖核苷酸免疫接种之前或在环状多核糖核苷酸免疫接种之后施用。[1033]例如，在一些实施例中，受试者用非环状多核糖核苷酸疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)和包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物免疫接种。在一些实施例中，受试者用第一微生物(例如，肺炎球菌)的非多核糖核苷酸疫苗和包含如本文披露的环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物免疫接种。疫苗可以是任何细菌感染疫苗或病毒感染疫苗。在一个特定实施例中，疫苗是肺炎球菌多糖疫苗，诸如pcv13或ppsv23。在一些实施例中，疫苗是流感疫苗。在一些实施例中，疫苗是rsv疫苗(例如，帕利珠单抗(palivizumap))。[1034]在一些实施例中，施用于受试者的组合物包含本文所述的线性多核糖核苷酸和疫苗。在一些实施例中，疫苗和线性多核糖核苷酸在分开的组合物中共同施用。该疫苗与线性多核糖核苷酸免疫接种同时施用，在线性多核糖核苷酸免疫接种之前或在线性多核糖核苷酸免疫接种之后施用。[1035]例如，在一些实施例中，受试者用多核糖核苷酸(例如，非线性多核糖核苷酸)疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)和包含如本文披露的包含编码免疫原的序列的线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物免疫接种。在一些实施例中，受试者用第一微生物(例如，肺炎球菌)的非多核糖核苷酸疫苗和包含如本文披露的包含编码免疫原的序列的线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物免疫接种。疫苗可以是任何细菌感染疫苗或病毒感染疫苗。在一个特定实施例中，疫苗是肺炎球菌多糖疫苗，诸如pcv13或ppsv23。在一些实施例中，疫苗是流感疫苗。在一些实施例中，疫苗是rsv疫苗(例如，帕利珠单抗(palivizumap))。[1036]其他实施例[1037]在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明所述的组合物、方法和用途的各种修改和变化对本领域技术人员将是显而易见的。虽已结合具体实施例描述了本发明，但应当理解，所要求的发明不应当过度地局限于此类具体实施例。事实上，对于本领域技术人员显而易见的用于进行本发明的所述方式的各种修改旨在落入本发明的范围内。[1038]所有出版物、专利和专利申请均通过援引以其全文并入本文，其程度如同特别且单独地指出将每个单独的出版物、专利或专利申请通过援引以其全文并入一样。[1039]实例[1040]提出旨在说明而非限制本披露的以下实例，以向本领域普通技术人员提供可以如何使用、实现和评价本文所述的组合物和方法的描述。这些实例旨在仅是本披露的示例，而无意限制发明人视为其发明的内容范围。[1041]实例1：编码免疫原的环状rna的设计[1042]该实例描述了编码免疫原的环状rna的设计。在该实例中，将环状rna设计成包括ires、编码免疫原的orf和侧接ires-orf的两个间隔元件。环化能够实现滚环翻译，具有交替交错元件以用于离散的orf表达和受控的蛋白质化学计量的多个orf，以及靶向rna以用于核糖体进入的ires。由环状rna编码的示例性免疫原是sars-cov-2免疫原(rbd和刺突)、流感h1n1免疫原、hpv免疫原和肿瘤新抗原。[1043]实例2：环状rna的生成和纯化[1044]在该实例中，通过两种示例性方法之一生成环状rna，并再次用rna纯化系统纯化。[1045]示例性方法1：dna夹板连接[1046]该示例性方法通过夹板连接产生环状rna。使用夹板dna将rpph处理的线性rna环化。使用t7rna聚合酶通过体外转录从dna区段合成未修饰的线性rna。转录的rna用rna纯化系统(新英格兰生物学实验室公司)纯化，用rna5'磷酸水解酶(rpph)(新英格兰生物学实验室公司，m0356)按照制造商的说明处理。替代性地或另外，rna在gmp相对于gtp过量的情况下转录。[1047]夹板连接如下进行：通过使用rna连接酶处理转录的线性rna和长度介于10至40个核苷酸之间的dna夹板来生成环状rna。为了纯化环状rna，在4％变性page上解析连接混合物，并切除对应于每个环状rna的rna条带。碾碎切除的rna凝胶片段，并用凝胶洗脱缓冲剂(0.5m乙酸钠、0.1％sds、1mmedta)在37℃下洗脱rna一小时。替代性地或另外，通过柱色谱法纯化环状rna。收获上清液，并通过向碾碎的凝胶中添加凝胶洗脱缓冲剂再次洗脱rna，并孵育一小时。通过离心过滤器去除凝胶碎片，并用乙醇沉淀。使用琼脂糖凝胶电泳作为验证纯度和环化的质量控制测量。[1048]示例性方法2：通过自剪接内含子进行环化[1049]该示例性方法通过自剪接产生环状rna。环状rna在体外生成。未修饰的线性rna从包括以上列出的所有基序的dna模板体外转录。体外转录反应包括1μg模板dnat7rna聚合酶启动子、10xt7反应缓冲液、7.5mmatp、7.5mmctp、7.5mmgtp、7.5mmutp、10mmdtt、40urna酶抑制剂和t7酶。在37℃下转录4小时。将转录的rna用1u的dna酶i在37℃下dna酶处理15分钟。为了有利于通过自剪接进行的环化，添加额外的gtp至终浓度2mm，在55℃下孵育15分钟。然后将rna进行柱纯化，并通过urea-page可视化。[1050]实例3：环状rna的多免疫原表达[1051]该实例描述了由环状rna表达多种免疫原。[1052]在该实例中，将一个环状rna设计为包括：ires(seqidno:1)；然后是编码免疫原1的orf，其对应于来自第一甲型h1n1流感毒株a/加利福利亚/07/2009(h1n1)的血凝素(ha)的一部分(seqidno:2)；终止密码子；ires(seqidno:1)；另一个编码免疫原2的orf，其对应于来自第二甲型h1n1流感毒株a/波多黎各/8/1934的血凝素(ha)的一部分(seqidno:3)；终止密码子和间隔子(seqidno:4)，参见图1a。根据本文所述的方法，在体外或在细胞中生成环状rna。[1053]简言之，将环状rna在兔网织红细胞裂解物(rrl；普洛麦格公司(promega)，美国威斯康星州菲奇堡(fitchburg,wi,usa))中于30℃下孵育1.5-3小时。反应混合物的最终组成包括70％兔网织红细胞裂解物、20μm氨基酸混合物(普洛麦格公司；l446a)和0.8u/μl核糖核酸酶抑制剂(普洛麦格公司，n211a)。通过三氯乙酸沉淀法去除血红蛋白。沉淀并离心后，弃去上清液并将团粒溶解在2xsds样品缓冲液(赛默公司(thermo))中，并在70℃下孵育15分钟。将样品在4％-12％梯度聚丙烯酰胺/十二烷基硫酸钠(sds)凝胶(赛默公司，np0326box)上解析，然后进行蛋白质印迹法(westernblotting)。使用半干法将蛋白质电转移到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜(赛默公司)上，进行印迹，并用特异性抗体探测，并在c-digit扫描仪(li-cor生物科学公司(li-corbiosciences))上通过化学发光可视化。使用image-studiolite(li-cor生物科学公司)定量表达水平。[1054]另外，在来自用erna转染的hela细胞的培养上清液中通过elisa测量免疫原1和免疫原2的表达。简言之，在opti-mem(英杰公司(invitrogen)；31985062)中使用messengermax(英杰公司；lmrna015)将0.1pmolerna转染到10,000个hela细胞中。在第1天和第2天收获细胞上清液。elisa如下进行：将捕获抗体于4℃在100μlpbs中包被到elisa板(maxisorp442404，96孔)上过夜。用tbs-t洗涤三次后，将板用封闭缓冲液(含2％fbs和0.05％吐温20的tbs)封闭1小时。然后将上清液稀释液添加到每个孔的100μl封闭缓冲液中，并在室温下孵育1小时。用tbs-t洗涤三次后，将板与hrp检测抗体在室温下孵育1小时。将四甲基苯(pierce34021)添加到每个孔中，使其反应5-15分钟，然后用2n硫酸淬灭。将在450nm下测定光密度(od)值。[1055]实例4：编码免疫原和佐剂的环状rna[1056]该实施例描述了环状rna表达免疫原并进一步编码佐剂的能力。佐剂可以表达或者可以对应于非表达的核酸序列，诸如先天性免疫刺激剂序列。[1057]在第一种情况下，将一个环状rna设计成包括ires，然后是编码免疫原的orf，终止密码子，ires，编码佐剂的另一个orf，终止密码子和间隔子，参见图1a。根据本文所述的方法，在体外或在细胞中生成并表达环状rna。[1058]在第二种情况下，将一个环状rna设计成包括ires，然后是编码免疫原的orf，终止密码子，并进一步编码不表达并通过刺激先天性免疫系统起佐剂作用的核酸序列(例如，富含gu的基序、富含au的基序、包含dsrna的结构化区域、或适体)，参见图2。根据本文所述的方法，在体外或在细胞中生成并表达环状rna。[1059]实例5：编码源自突变变体的多种免疫原的环状rna[1060]对于该实例，环状rna编码两种彼此为突变变体的多肽免疫原，使得它们具有至少90％且小于100％的氨基酸序列同一性(图1a-1b)。多肽免疫原各自包括对应于相同蛋白质的一个或多个表位。多肽免疫原可以是与遗传漂变相关的内源发生的多肽免疫原或其修饰形式。设计具有起始密码子、表达序列、交错元件和ires的环状rna(图1b)。环化可实现被交错元件分隔开的多个表达序列的滚环翻译。[1061]与流感病毒相关的血凝素蛋白中的突变变体是本领域技术人员已知的。由于病毒聚合酶的低保真度，将突变变体引入血凝素蛋白中，产生不再具有相同序列的血凝素蛋白(wong等人(2011)j.med.virol.[医学病毒学杂志],83:510-516)。因此，对应于血凝素的各种突变变体的多种免疫原由环状rna编码，其中这多种免疫原中的每一种具有至少95％的序列同一性。环状rna包括起始密码子，包括源自与流感病毒头部相关的血凝素蛋白的多肽免疫原的第一orf，交错元件，包括源自血凝素蛋白的突变变体的多肽免疫原的第二orf，以及任选的ires。[1062]实例6：编码源自相同靶标的多种免疫原的环状rna[1063]对于该实例，环状rna编码源自两种不同蛋白质的两种多肽免疫原，但是其中两种蛋白质都鉴别相同的靶标。设计具有起始密码子、表达序列、交错元件和ires的环状rna(图1b)。环化可实现被交错元件分隔开的多个表达序列的滚环翻译。[1064]具体地，环状rna编码起始密码子、包含源自hiv-1包膜糖蛋白120(gp120)的多肽免疫原的第一orf、任选的交错元件、包含源自hiv-1包膜糖蛋白41(gp41)的多肽免疫原的第二orf和任选的ires，其中hiv-1包膜蛋白是多肽免疫原的靶标。三个gp120和三个gp41组合为异二聚体的三聚体，其中gp120的三聚体是头部区域而gp41的三聚体是尾部区域，它们一起形成hiv-1的包膜刺突。因此，源自gp120和gp41的多肽免疫原都包含在环状rna中，以靶向hiv-1包膜蛋白。[1065]实例7：编码源自不同靶标的多种免疫原的环状rna[1066]对于该实例，环状rna编码源自两种不同蛋白质的两种多肽免疫原，两种不同蛋白质鉴别彼此不同的靶标。设计具有起始密码子、表达序列、交错元件和ires的环状rna(图1b)。环化可实现被交错元件分隔开的多个表达序列的滚环翻译。[1067]源自不同靶标的多种免疫原由环状rna编码，该环状rna如此设计成具有起始密码子，编码源自水痘-带状疱疹病毒(varicellazostervirus)的包膜糖蛋白1(gp1)的多肽免疫原的orf，交错序列和源自血凝素的多肽免疫原。水痘-带状疱疹病毒至少有6种包膜糖蛋白，并且糖蛋白gp1、gp2、gp3可以诱导人体产生中和抗体(zweerink等人，1981；31(1):436-444)。同样，两种包膜糖蛋白、血凝素和融合蛋白也是麻疹病毒(morbillivirus)的已知免疫原。因此，编码源自gp1的多肽免疫原和源自血凝素的多肽免疫原的环状rna均靶向水痘-带状疱疹病毒和麻疹病毒。[1068]实例8：来自环状rna的多免疫原施用[1069]该实例描述了通过施用多个环状rna分子在受试者中表达多种免疫原。[1070]在该实例中，将环状rna1设计成包括ires(seqidno:1)；然后是编码免疫原1的orf，其对应于来自第一甲型h1n1流感毒株a/加利福利亚/07/2009的血凝素(ha)的一部分(seqidno:2)；终止密码子和间隔子(seqidno:4)，参见图2。将环状rna2设计成包括ires(seqidno:1)；然后是编码免疫原2的orf，其对应于来自第二甲型h1n1流感毒株a/波多黎各/8/1934的血凝素(ha)的一部分(seqidno:3)；终止密码子，和间隔子(seqidno:4)，参见图3。通过体外转录(lucigen；as3107)和使用所述的rna连接酶进行rna连接通过本文提供的方法产生环状rna。[1071]配制如本文所述的编码多种不同免疫原的多个环状rna，以施用于哺乳动物受试者。[1072]环状rna以本文包括的任何配制品的形式配制。这些配制的rna在第0天经由合适途径，即皮内、皮下、肌内或静脉内途径注射。[1073]评价从哺乳动物受试者收集的血液或组织中分泌型免疫原的表达。在给药后1、2、7、14和21天将血样收集在无抗凝剂的试管中。通过在4℃下以1300g离心25分钟来分离血清，并通过elisa测量分泌型蛋白质的表达。简言之，将捕获抗体于4℃在100μlpbs中包被到elisa板(maxisorp442404，96孔)上过夜。用tbs-t洗涤三次后，将板用封闭缓冲液(含2％fbs和0.05％吐温20的tbs)封闭1小时。然后将上清液稀释液添加到每个孔的100μl封闭缓冲液中，并在室温下孵育1小时。用tbs-t洗涤三次后，将板与hrp检测抗体在室温下孵育1小时。将四甲基苯(pierce34021)添加到每个孔中，使其反应5-15分钟，然后用2n硫酸淬灭。在450nm下测定光密度(od)值。[1074]实例9：由多种环状rna编码的免疫原和佐剂的共同施用[1075]该实例证明将多种环状rna施用给受试者会刺激免疫反应。施用给受试者的一种环状rna编码多肽免疫原。施用给受试者的另一种环状rna编码佐剂(图3)。[1076]在该实例中，设计编码多肽免疫原的环状rna，生产、纯化并制备为配制品。为了刺激免疫反应，设计、生产、纯化和制备本领域技术人员已知会充当佐剂的包含聚u的单独环状rna作为药物配制品。编码多肽免疫原和聚u佐剂的环状rna的配制品以彼此不同的配制品同时施用给受试者。[1077]实例10：由环状rna编码的免疫原和小分子佐剂的共同施用[1078]该实例证明将环状rna与小分子佐剂组合施用给受试者会刺激免疫反应。[1079]在该实例中，设计编码多肽免疫原的环状rna，生产、纯化并制备为配制品。为了刺激免疫反应，向受试者施用小分子佐剂，诸如佐剂。将编码多肽免疫原的环状rna的配制品和小分子佐剂都同时施用于受试者。[1080]实例11：包括各自编码对应于不同靶标的多肽免疫原的多个环状rna的免疫原性组合物的共同施用[1081]对于该实例，将各自编码多肽免疫原的多个环状rna施用于受试者(图3)。[1082]将编码如本领域中已知的源自包膜蛋白血凝素的多肽免疫原以鉴别麻疹病毒靶标的一种环状rna施用于受试者。还将编码本领域中已知的源自包膜蛋白糖蛋白e的多肽免疫原以鉴别水痘-带状疱疹病毒靶标的另一环状rna施用于受试者。设计、生产、纯化两种环状rna并制备成配制品。将包含两种环状rna的配制品施用于受试者。[1083]实例12：使用环状rna在哺乳动物中体内诱导针对免疫原的抗体[1084]配制如本文所述的编码免疫原的环状多核苷酸以施用于哺乳动物受试者。该配制品在盐水中或在本文所传授的任何配制品中。含环状多核苷酸的疫苗任选地含有一种或多种树突靶向剂或部分。在第0天，经由合适的途径，皮内、皮下、肌内或静脉内途径注射包含编码免疫原的多核苷酸的疫苗。可以将编码免疫刺激剂或免疫刺激部分的多核苷酸与编码免疫原的多核苷酸共同施用以刺激免疫反应。按每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次或每八周一次对含有编码免疫原的环状多核苷酸的疫苗给予另外的攻击，直至检测到抗免疫原的抗体。施用另外的疫苗攻击以加强免疫原特异性抗体的产生。[1085]实例13：检测哺乳动物细胞中来自环状rna的蛋白质或免疫原表达[1086]为了测量来自rna构建体的非分泌型蛋白质或免疫原的表达效率，根据本文所述的方法生产和纯化编码蛋白质或免疫原的环状rna(0.1皮摩尔)。使用messengermax(英杰公司，lmrna)将环状rna转染到hek293(96孔板中无血清培养基中，每孔10,000个细胞)中。[1087]对于非分泌型蛋白质或免疫原，使用免疫原特异性elisa在24、48和72小时测量蛋白质表达。为了测量表达，在适当的时间点在每个孔中使用裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂裂解细胞。回收细胞裂解液，并以12,000rpm离心10分钟。收集上清液。[1088]对于分泌型蛋白质或免疫原，使用免疫原特异性蛋白质印迹法(westernblot)在24、48和72小时检测免疫原表达。简言之，从每个孔中取80μl来自哺乳动物细胞的上清液。通过bca蛋白质测定方法测量收获的培养基中的蛋白质水平，并将相同量的蛋白质在4％-12％梯度的bis-tris凝胶(赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific))上解析，并使用iblot2转移系统(赛默飞世尔科技公司)转移到硝酸纤维素膜上。使用抗免疫原抗体(义翘神州生物技术有限公司(sinobiological))检测免疫原。通过ibrightfl1500成像系统(英杰公司)监测来自蛋白质条带的化学发光信号。[1089]实例14：哺乳动物细胞中来自环状rna的rbd免疫原表达[1090]该实例证明哺乳动物细胞中来自环状rna的rbd免疫原表达。[1091]在该实例中，根据本文所述的方法生产和纯化编码sars-cov-2rbd免疫原的环状rna。[1092]通过免疫沉淀联合蛋白质印迹法(ip-western)测试编码rbd的环状rna的表达。简言之，使用lipofectaminemessengermax(赛默飞世尔公司(thermofisher)，lmrna015)将编码rbd免疫原的环状rna(0.1皮摩尔)转染到bj成纤维细胞和hela细胞(10,000个细胞)中。使用单独的messengermax作为对照。在24小时时收集上清液，并使用对与蛋白g-戴诺磁珠(proteing-dynabeads)(英杰公司，10003d)偶联的sars-cov-2rbd-刺突糖蛋白(义翘神州生物技术有限公司，目录号：40592-t62)有特异性的兔抗体进行免疫沉淀并使用相同抗体检测通过page解析的免疫沉淀产物。使用重组rbd(42ng)免疫沉淀作为对照并定量细胞蛋白的表达。使用imagestudiotmlite蛋白质印迹法定量软件(li-cor生物科学公司)对膜化学发光进行定量。[1093]在bj成纤维细胞和hela细胞上清液中检测到由环状rna编码的rbd免疫原，而在对照中则未检测到(图4)。[1094]该实例表明，sar-cov-2rbd免疫原(是分泌型蛋白)是从哺乳动物细胞中的环状rna中表达的。[1095]实例15：sars-cov-2rbd免疫原在小鼠模型中的免疫原性[1096]在小鼠模型中评价了用阳离子聚合物(例如，鱼精蛋白)配制的编码sars-cov-2rbd免疫原的环状rna的免疫原性。在小鼠模型中还评价了用阳离子聚合物配制的针对sars-cov-2rbd免疫原的抗体的产生。[1097]在该实例中，将环状rna设计成具有ires和编码sars-cov-2rbd免疫原的orf以及侧接ires-orf的两个间隔元件。环状rna如下生成。以过量的5’单磷酸鸟苷，使用t7rna聚合酶通过体外转录从dna区段合成未修饰的线性rna。按照制造商的说明，用rna纯化系统(新英格兰生物学实验室公司)纯化转录的rna。使用夹板dna将纯化的线性rna环化。[1098]通过分裂连接生成环状rna，如下：将转录的线性rna和dna夹板混合并退火，并用rna连接酶处理。为了纯化环状rna，通过反相色谱法解析连接混合物。通过增加流动相的有机物含量，从线性rna中选择性洗脱环状rna。分级收集洗脱的rna，并测定其环状rna的纯度。合并选择的级分并交换缓冲液以去除流动相盐和溶剂。使用丙烯酰胺凝胶电泳作为验证纯度和环化的质量控制测量。[1099]将纯化的环状rna在纯净水中稀释至1100ng/μl的浓度。将硫酸鱼精蛋白溶解在林格氏乳酸溶液(4000ng/μl)中。在搅拌的同时，将鱼精蛋白-林格氏乳酸溶液添加到一半环状rna溶液中，直到rna:鱼精蛋白的重量比为2:1。将该溶液再搅拌10分钟以确保形成稳定的复合物。然后添加剩余的环状rna(即，将剩余的环状rna添加到环状rna:鱼精蛋白溶液中)，并短暂搅拌该溶液。使用林格氏乳酸溶液调节混合物(即，环状rna混合物)的最终浓度，以获得环状rna制剂，其最终rna浓度为50μl中2μg或10μgrna。[1100]每组三只小鼠在第0天和第21天经肌内或皮内接种2μg或10μg剂量的环状rna制剂或鱼精蛋白媒介物对照。在第0天和第21天施用环状rna制剂后24小时，经肌内或皮内向每只小鼠施用addavaxtm佐剂(英杰公司)一次。按照制造商的说明，addavaxtm佐剂按50μl在1xpbs中以50％给药。[1101]通过亚摩尔抽吸从每只小鼠收集血液。在环状rna给药后第7、14、21、23、28、35、41、49、56、63、69、77、84、108和115天，将血液收集到干燥的无抗凝剂的试管中。通过在4℃以1200g离心30分钟从全血中分离血清。通过56℃加热1小时使血清热灭活。通过酶联免疫吸附测定(elisa)，测定各个热灭活的血清样品中是否存在rbd特异性igg。将elisa板(maxisorp44240496孔，能肯公司(nunc))在4℃下用在100μlpbs中的sars-cov-2rbd(义翘神州生物技术有限公司，40592-v08b；100ng)包被过夜。然后用封闭缓冲液(含2％fbs和0.05％吐温20的tbs)将板封闭1小时。然后将血清稀释液添加到每个孔的100μl封闭缓冲液中，并在室温下孵育1小时。用含洗涤剂的1xtris缓冲液(tbs-t)洗涤三次后，将板与抗小鼠igghrp检测抗体(jackson115-035-071)孵育1小时，接着用tbs-t洗涤三次，然后添加四甲基苯(pierce34021)。使elisa板反应5分钟，然后使用2n硫酸淬灭。在450nm下测定光密度(od)值。[1102]将每个血清样品的光密度除以背景(包被有rbd，仅与二抗孵育的板)的光密度。绘制每个样品相对于背景的倍数。[1103]结果显示，在注射环状rna制剂后第14、21、23、28、35、41、49、56、63、69、77、84、108和115天获得抗rbd反应(图5)。注射鱼精蛋白媒介物后未获得抗rbd抗体。这些结果显示，编码rbd免疫原的环状rna在小鼠中诱导抗原特异性免疫反应。[1104]使用类似的elisa测定血清样品中是否存在刺突特异性igg。将elisa板(maxisorp44240496孔，能肯公司)在4℃下用在100μlpbs中的sars-cov-2刺突(义翘神州生物技术有限公司，40589-v08b1；100ng)包被过夜。然后用封闭缓冲液(含2％fbs和0.05％吐温20的tbs)将板封闭1小时。然后将血清稀释液添加到每个孔的100μl封闭缓冲液中，并在室温下孵育1小时。用含洗涤剂的1xtris缓冲液(tbs-t)洗涤三次后，将板与抗小鼠igghrp检测抗体(jackson115-035-071)孵育1小时，接着用tbs-t洗涤三次，然后添加四甲基苯(pierce34021)。使elisa板反应5分钟，然后使用2n硫酸淬灭。在450nm下测定光密度(od)值。[1105]结果显示，在注射环状rna制剂后35天获得抗刺突抗体(图6)。注射媒介物后未获得抗刺突抗体。[1106]在给药后第14天，使用测量相对igg1与igg2a同种型的测定法来表征血清抗体(图7)，并且使用prnt中和测定法来表征血清抗体中和病毒的能力。结果显示，随佐剂一起肌内给药2μgrbd环状rna具有中和能力。[1107]实例16：用于向非人类动物施用的环状rna的配制[1108]根据本文所述的方法设计并纯化编码sars-cov-2免疫原或作为模型免疫原的高斯荧光素酶(gluc)的环状rna。纯化后，如下配制环状rna或mrna：[1109]a.将环状rna或mrna在pbs中稀释到50μl中为2.5皮摩尔或25皮摩尔的最终浓度，以获得环状或线性rna制剂(未配制)。[1110]b.用脂质载剂(例如transit(米卢斯生物公司(mirusbio)))和mrna增进试剂(米卢斯生物公司)根据制造商的说明(15％transit、5％增进剂)配制环状rna或mrna，以获得50μl中2.5皮摩尔或25皮摩尔的最终rna浓度，以获得环状或线性rna制剂。[1111]c.将环状rna或mrna用阳离子聚合物(例如，鱼精蛋白)配制。简言之，将环状rna在纯净水中稀释。将硫酸鱼精蛋白溶解在林格氏乳酸溶液(4000ng/μl)中。在搅拌的同时，将鱼精蛋白-林格氏乳酸溶液添加到一半环状rna或mrna溶液中，直到rna:鱼精蛋白的重量比为2:1。将该溶液再搅拌10分钟以确保形成稳定的复合物。然后添加剩余的环状rna或mrna，并短暂搅拌溶液。使用林格氏乳酸溶液调节该溶液的最终浓度，使得环状rna或线性rna制剂的最终浓度为2.5皮摩尔或25皮摩尔/50μl。[1112]d.用脂质纳米颗粒配制环状rna或mrna。简言之，将环状rna或mrna在ph＝4的25mm乙酸盐缓冲液中稀释(通过0.2μm过滤器过滤)到0.2μg/μl的浓度。首先通过将可电离脂质(例如alc0315)、胆固醇、dspc和dmg-peg2000以50/38.5/10/1.5mol％的摩尔比溶解在乙醇中(通过0.2μm无菌过滤器过滤)来配制脂质纳米颗粒(lnp)。最终可电离脂质/rna重量比为8/1w/w。使用微流体系统将脂质和rna溶液在微混合器芯片中混合，流速比为3/1缓冲液/乙醇且总流速为1ml/min。然后将lnp在ph＝7.4的pbs中透析3小时以去除乙醇。使用ribogreen测定法测量lnp内部的rna浓度和包封效率。如有必要，可使用截止值为100kda的amicon离心过滤器将lnp浓缩至所需的rna浓度。使用zetasizerultra(马尔文帕纳科(malvernpananaytical))测量颗粒的大小、浓度和电荷。用pbs将rna浓度调节至0.1或0.2μg/μl的最终浓度。对于含有两种rna序列的配制品，在lnp中配制之前或在单独配制每种rna之后将rna混合。对于体内实验，通过无菌的0.2μm再生纤维素过滤器过滤lnp中配制的最终rna。[1113]实例17：使用定时佐剂递送调节小鼠体内由环状rna产生高斯荧光素酶[1114]该实例证实在递送佐剂以刺激免疫反应的同时，体内由环状rna表达蛋白质或免疫原。[1115]在该实例中，根据本文所述的方法生产和纯化编码gluc的环状rna。如实例16中所述配制环状rna，以获得环状rna制剂(例如，trans-it配制的，鱼精蛋白配制的，pbs/未配制的)。经由后腿单次肌内注射向小鼠施用每种环状rna制剂的50μl注射液。通过单次皮内注射向另一组小鼠背部皮内施用鱼精蛋白配制的环状rna制剂。[1116]为了刺激免疫反应，在0小时或24小时将addavaxtm佐剂(英杰公司)(一种基于角鲨烯的水包油纳米乳剂，其配方类似于佐剂)注射至小鼠后腿(与环状rna制剂同时递送)。根据制造商的说明，addavaxtm佐剂按50μl给药。[1117]通过亚摩尔抽吸从每只小鼠收集血样(～25μl)。在环状rna给药后0、6、24和48小时，将血液收集到edta试管中。通过在4℃下以1300g离心30分钟分离血浆，并使用高斯荧光素酶活性测定法(赛默科技皮尔斯公司(thermoscientificpierce))测试了高斯荧光素酶(一种分泌酶)的活性。将50μl1xgluc底物添加到5μl血浆中，以进行gluc荧光素酶活性测定。在发光检测仪(普洛麦格公司)中混合后立即读取平板。[1118]该实例证明使用以下方法可在长时间内在体内从环状rna成功表达蛋白质：(a)肌内注射transit配制的、鱼精蛋白配制的和未配制的环状rna制剂，不递送佐剂(图8)和在0和24小时递送佐剂(图9)；以及(b)皮内注射鱼精蛋白配制的环状rna制剂，不递送佐剂和在24小时递送佐剂(图10)。[1119]实例18：通过评估rna酶h产生的核酸降解产物表征环状rna制剂[1120]该实例证明评估环状rna制剂中rna酶h产生的核酸降解产物可以检测线性和连环化产物相对于环状产物。[1121]与连接酶一起孵育时，rna不能反应或形成分子内或分子间键，分别生成环状(无游离末端)或连环化rna(线性的)。使用互补dna引物和rna酶h(一种识别dna/rna双链体的非特异性核酸内切酶)处理每种类型的rna，预期会依据起始rna物质产生独特数量的具有特定大小的降解产物。[1122]基于rna酶h降解产生的rna的数目和大小，可证实连接的rna是无连环化rna污染的环状rna或有连环化rna污染的环状rna。将引物和rna酶h添加到环状rna中时，单个引物与环状rna形成双链体，而rna酶h降解dna/rna双链体区以产生单一线性rna产物。当将引物和rna酶h添加到连环体中时，至少两个引物与连环化rna形成双链体，而rna酶h降解dna/rna双链体以产生三种产物；一种产物是从5’末端到第一引物结合区的rna，一种产物是在第一引物结合区和下一引物结合区之间的rna，根据连接在一起的连环体的数目，其可以包括多个rna，并且最后一种产物是从最后一个引物结合区到3'末端的rna。将引物和rna酶h添加到线性rna中时，单个引物与线性rna形成双链体以产生从5’末端到引物结合区的一种rna产物和引物结合区到3’末端的另一种rna产物。图11的左侧草图说明了该策略。[1123]在该实例中，环状rna如下生成。使用t7rna聚合酶通过体外转录从dna区段合成未修饰的线性rna。转录的rna用rna纯化系统(新英格兰生物学实验室公司)纯化，按照制造商的说明用rna5'焦磷酸水解酶(rpph)(新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并再次用rna纯化系统纯化。将环状rna设计成包括ires以及编码纳米荧光素酶(nluc)的orf和侧接ires-orf的两个间隔元件。[1124]为了测试rna的环化状态，将0.05pmol/μl线性rna或环状rna制剂与0.25u/μlrna酶h(消化dna/rna双链体的内切核糖核酸酶)和0.3pmol/μl的与nlucrna互补的10至30个核酸互补的寡聚体在37℃下孵育30分钟。孵育后，通过6％变性page分析反应混合物。将凝胶用sybr-green染色并通过e-凝胶成像仪可视化。通过imagej测量和分析可视化凝胶上的条带强度。[1125]图11的右侧示出了该实验中的实际裂解产物。线性rna泳道中该数目的条带与rna酶h核酸内切酶一起孵育产生了预期的两个条带，而在泳道a的情况下在环状rna泳道中检测到单条条带，表明环状rna实际上是环状的而非连环化的。在泳道b和泳道c的情况下，在rna酶h处理后由于rna酶h泳道中出现多个较小的片段条带，可见来自线性和连环化污染的条带。[1126]实例19：环状rna制剂中的线性rna(标准曲线)[1127]此实例展示了环状rna制剂中线性rna的计算。[1128]在此实例中，如下生成环状rna。使用t7rna聚合酶通过体外转录从dna区段合成未修饰的线性rna。转录的rna用rna纯化系统(新英格兰生物学实验室公司)纯化，按照制造商的说明用rna5'焦磷酸水解酶(rpph)(新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并再次用rna纯化系统纯化。将环状rna设计成包括ires以及编码纳米荧光素酶(nluc)的orf和侧接ires-orf的两个间隔元件。[1129]通过用t4dna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)处理转录的线性rna和dna夹板来生成夹板连接的环状rna。[1130]为了纯化环状rna，在4％变性page上解析连接混合物，并且切除对应于环状rna中的每一种的rna条带。压碎切除的rna凝胶片段，并且用凝胶洗脱缓冲液(0.5mnaoac，1mmedta和0.1％sds)在37℃下洗脱rna。收获上清液，并且通过将凝胶洗脱缓冲液添加至压碎凝胶中再洗脱一次rna，并孵育一小时。通过离心过滤器去除凝胶碎片，并且用乙醇沉淀rna。通过6％变性page分析洗脱的环状rna。将凝胶用sybr-green染色并通过e-凝胶成像仪可视化。[1131]通过比较已知量和相同大小的rna(标准rna)的条带强度来确定凝胶上rna的量。生成标准曲线以确定凝胶上未知样品的量(图12)。为了生成标准曲线，将1、0.5、0.2和0.05pmol的环状rna的线性对应物与环状rna制剂平行加载在6％变性page上。将变性凝胶用sybr-绿染色并且通过e-凝胶成像仪可视化。然后通过imagej测量和分析凝胶上的每条条带强度。通过分析加载在不同泳道中的每一个中的rna的条带强度，生成线性rna的标准曲线(在所有情况下r2》0.98)，并且基于线性rna标准曲线确定环状rna制剂中线性rna的量。[1132]不同样品中线性rna的量如下：对于环状rna制剂a：计算线性rna为大约0.31mol/mol、或115.99ng/395ng、或30.2％。对于环状rna制剂c：计算线性rna为大约0.45mol/mol、或260.52ng/488ng、或49.2％。[1133]实例20：环状rna制剂中的线性rna(凝胶切除和提取)[1134]此实例展示了对制剂中环状rna的纯化和定量。[1135]在此实例中，如下生成环状rna。使用t7rna聚合酶通过体外转录从dna区段合成未修饰的线性rna。将转录的rna用rna纯化系统(新英格兰生物学实验室公司)纯化，按照制造商的说明用rna5'-焦磷酸水解酶(新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并且再次用rna纯化系统纯化。将环状rna设计成包括ires以及编码纳米荧光素酶(nluc)的orf和侧接ires-orf的两个间隔元件。[1136]通过用t4dna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)处理转录的线性rna和dna夹板来生成夹板连接的环状rna。[1137]为了纯化环状rna，在6％变性page上解析连接混合物，并且切除对应于环状rna中的每一种的rna条带。压碎切除的rna凝胶片段，并且用凝胶洗脱缓冲液(0.5mnaoac，1mmedta和0.1％sds)在37℃下洗脱rna。收获上清液，并且通过将凝胶洗脱缓冲液添加至压碎凝胶中再洗脱一次rna，并孵育一小时。通过离心过滤器去除凝胶碎片，并且在0.3m乙酸钠存在时用乙醇沉淀rna。通过6％变性page分析洗脱的环状rna。将凝胶用sybr-绿染色并且通过e-凝胶成像仪可视化(图13)。再次切除可见条带并且使用凝胶破碎机压碎。为了提取rna，将凝胶洗脱缓冲液(0.5mnaoac，1mmedta，0.1％sds)添加至压碎凝胶中并且在37℃下孵育1小时。收获上清液，并且通过将凝胶洗脱缓冲液添加至压碎凝胶中再洗脱一次rna，并孵育一小时。通过旋转x柱去除凝胶碎片，并且乙醇沉淀所提取的rna。通过qubit3荧光计测量来自单独条带的所提取rna。[1138]如下定量来自不同样品的所提取rna：(制剂a)大约1446ng环状rna和176ng线性rna(89.1％环状rna)；(制剂b)大约934ng环状rna和270ng线性rna(77.5％环状rna)；以及(制剂c)大约320ng环状rna和396ng线性rna(44.6％环状rna)。[1139]实例21：环状rna制剂中的线性rna[1140]此实例展示了产生相对于制剂中的总核糖核苷酸分子91％(w/w)纯的环状rna分子并且随后在小鼠中的给予以生成生物学效应。[1141]在此实例中，环状rna包括ires、编码高斯荧光素酶(gluc)的orf、和侧接ires-orf的两个间隔元件。[1142]在此实例中，在体外生成环状rna。未修饰的线性rna从包括上面列出的所有基序的dna模板以及用于驱动转录的t7rna聚合酶启动子体外转录。转录的rna用rna纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，t2050)纯化，按照制造商的说明用rna5’磷酸水解酶(rpph)(新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并再次用rna纯化柱纯化。使用长度为10至40个核苷酸的夹板dna和t4rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)将rpph处理的线性rna环化。将环状rna进行尿素-page纯化，在缓冲液(0.5m乙酸钠、0.1％sds、1mmedta)中洗脱，经乙醇沉淀并重悬于rna储存溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7000)中。[1143]线性多核糖核苷酸保留在最终的环状rna产品制剂中。通过以下方式对每个批次的最终产品制剂中环状rna的纯度和剩余线性rna的百分比进行定量：在6％tbe-尿素凝胶上运行最终产品制剂并且使用imagej分析条带。通过计算环状rna相比于总rna强度的强度来评估纯度，并且将其以百分比表示。在此，相对于制剂中的总rna，环状rna具有91％(w/w)纯度。[1144]在施用前，添加pbs和10％transit载体以在100μl最终体积中实现0.25pmol的所期望最终环状rna浓度。使小鼠接受0.25pmol编码高斯荧光素酶orf的环状rna(100μl)的单次静脉内尾静脉注射。[1145]通过亚摩尔抽取从每只小鼠收集血液样品(约25μl)。在给予后0、6小时、1、2、3、7、14、21、28和35天，收集血液到edta管中。通过在4℃下以1300g离心30分钟分离血浆，并使用高斯荧光素酶活性测定法(赛默科技皮尔斯公司(thermoscientificpierce))测试了高斯荧光素酶(一种分泌酶)的活性。简而言之，将50μl1xgluc底物添加至5μl血浆中，以进行gluc荧光素酶活性测定。在发光检测仪(普洛麦格公司)中混合后立即读取平板。[1146]在给予环状rna后6小时和1、2、3、7、14和21天，在血浆中检测到高斯荧光素酶活性。在注射后大约2天观察到环状rna的最高表达，并且高水平的表达在延长的时间段内得以维持且在21天仍是可检测的。在所有时间点，这些活性水平大于对于阴性对照(仅pbs媒介物)观察到的活性水平。[1147]此实例展示了，成功产生了相对于制剂中的总rna具有91％(w/w)纯度的环状rna，该环状rna经由静脉内注射成功递送，并且能够在延长的时间内表达在血液中可检测的蛋白质。[1148]实例22：对凝胶纯化的环状rna中带切口环状rna的定量[1149]此实例展示了通过凝胶提取纯化的环状rna含有相对于制剂中的总rna分子不超过1.1％(w/w)的带切口rna。[1150]在此实例中，rna包括ires、编码高斯荧光素酶(gluc)的orf、和侧接ires-orf的两个间隔元件。[1151]在此实例中，在体外生成环状rna。未修饰的线性rna从包括上面列出的所有基序的dna模板以及用于驱动转录的t7rna聚合酶启动子体外转录。转录的rna用rna纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，t2050)纯化，按照制造商的说明用rna5’磷酸水解酶(rpph)(新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并再次用rna纯化柱纯化。使用长度为10至40个核苷酸的夹板dna和t4rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)将rpph-处理的线性rna环化。此举导致rna在连接接合点处的环化以生成环状rna。将环状rna在4％page凝胶上进行尿素-page纯化，在缓冲液(0.5m乙酸钠，0.1％sds，1mmedta)中洗脱，乙醇沉淀并且重悬于rna储存溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7000)中。在此实例中，评价经纯化的环状rna相对于制剂中的总rna具有80％(w/w)的纯度。[1152]在此实例中，通过下一代测序来评估线性rna的序列。使用truseq小rna工作流程(依诺米那公司(illumina)，rs-200-0012)中描述的文库制备方法制备经纯化的环状rna制剂(80％纯度)用于ngs管线。此方法以高保真度保留了3'端身份。简而言之，将衔接子连接至溶液中具有可用3'或5'端的任何rna分子。完整的环状rna不会进行这种连接-因此，此步骤仅选择非环状rna。然后将这些产物逆转录并且扩增以生成cdna文库，随后对其进行纯化、质量控制和多路复用。然后在依诺米那公司miniseq机器上对文库进行测序。[1153]以与上述类似的方式，对rpph处理之后的来自体外转录的线性rna产物进行处理以进行测序。[1154]通过以下方式来比较ivt的线性rna产物和凝胶纯化的环状rna制剂中的非环状rna两者的测序结果：将读数取映射回至用于生成环状rna的模板序列并且评价在连接接合点上映射的读取数量。[1155]在此分析中，假设剩余的非环状rna是带切口rna和来自ivt的残余线性rna产物的混合物。在此实例中，如果假设非环状rna仅包含带切口rna，则预计在连接接合点上映射的片段百分比为50％。如果假设非环状rna仅包含来自ivt的剩余线性rna产物，则预计在连接接合点上映射的片段百分比为0％。使用这些统计假设和对照实验，生成了使得能够定量带切口rna的标准曲线。这产生了5.4％的非环状rna为带切口rna的计算结果。[1156]此实例展示了经纯化的环状rna制剂的非环状rna级分的5.4％(w/w)(相当于总rna的1.1％(w/w))是带切口rna。[1157]实例23：环状rna制剂中存在的线性rna的减少增加编码蛋白质的表达[1158]此实例展示了减少主要为环状rna的组合物中存在的线性rna增加编码蛋白质在细胞中的表达。[1159]对于此实例，环状rna包括ires、编码高斯荧光素酶(gluc)的orf、和侧接ires-orf的两个间隔元件。[1160]生成两个批次环状rna。在每种情况下，在体外生成环状rna。未修饰的线性rna从包括上面列出的所有基序的dna模板以及用于驱动转录的t7rna聚合酶启动子体外转录。转录的rna用rna纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，t2050)纯化，按照制造商的说明用rna5’磷酸水解酶(rpph)(新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并再次用rna纯化柱纯化。使用长度为10至40个核苷酸的夹板dna和t4rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)将rpph处理的线性rna环化。将环状rna进行尿素-page纯化，在缓冲液(0.5m乙酸钠，0.1％sds，1mmedta)中洗脱，乙醇沉淀，并且重悬于rna储存溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7000)中。[1161]线性rna保留在最终的环状rna产品中。通过以下方式对每个批次的最终产品中环状rna的纯度和剩余线性rna的百分比进行定量：在6％tbe-尿素凝胶上运行最终产品并且使用imagej分析条带。通过计算circrna相比于总rna强度的强度来评估circrna纯度，并且将其以百分比表示。在此，批次具有71％纯度和84％纯度。[1162]将0.2pmol每个rna批次用于细胞转染。根据制造商的建议，将rna与optimem和messengermax合并。类似地制备仅媒介物对照但不含任何rna。在时间＝0时，将每种制剂添加至bj成纤维细胞中。[1163]使用高斯荧光素酶活性测定法(赛默科技皮尔斯公司(thermoscientificpierce))测试高斯荧光素酶的活性。将20μl细胞上清液的样品添加至96孔板(康宁公司(corning)3990)中。在转染后6、24、48、72、96和120小时获取样品。简言之，将1x腔肠素(coelenterazine)底物添加到每个孔中。添加底物并在光度计仪器(普洛麦格公司)中混合后立即读板。[1164]在转染后6、24、48、72、96和120小时，在使用具有84％纯度的环状rna的实验中在细胞中检测到高斯荧光素酶活性(图12)，并且高于仅媒介物对照所提供的表达。衍生自具有84％纯度的环状rna的表达显著高于衍生自具有71％纯度的环状rna的表达。在转染后24小时，与转染具有71％纯度的环状rna时相比，转染具有84％纯度的环状rna时的gluc活性高397倍。在转染后6、24、48和72小时，在使用具有71％纯度的环状rna的实验中在细胞中检测到gluc活性(图14)，并且高于仅媒介物对照所提供的表达。[1165]此实例展示了具有更高纯度(具有减少的线性rna)的环状rna增加并且延长编码蛋白质的表达。[1166]实例24：环状rna制剂中存在的线性rna以剂量依赖性方式影响在细胞中的先天性免疫反应[1167]此实例展示了环状rna制剂中存在的线性rna以剂量依赖性方式负面影响先天性免疫反应。[1168]在此实例中，如下生成环状rna和线性rna。使用t7rna聚合酶通过体外转录从dna区段合成未修饰的线性rna。转录的rna用rna纯化系统(新英格兰生物学实验室公司)纯化，按照制造商的说明用rna5'焦磷酸水解酶(rpph)(新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并再次用rna纯化系统纯化。环状rna被设计为包括ires以及编码高斯荧光素酶(gluc)的orf和侧接ires-orf的两个间隔元件。[1169]通过用t4rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)处理转录的线性rna和dna夹板来生成夹板连接的环状rna。[1170]为了纯化环状rna，在4％变性page上解析连接混合物，并且切除对应于环状和线性rna中的每一种的rna条带。使用相同的4％变性page凝胶纯化线性rna。压碎切除的rna凝胶片段(线性或环状)，并且用凝胶洗脱缓冲液(0.5mnaoac，1mmedta和0.1％sds)在37℃下洗脱rna。收获上清液，并且通过将凝胶洗脱缓冲液添加至压碎凝胶中再洗脱一次rna，并孵育一小时。通过离心过滤器去除凝胶碎片，并且用乙醇沉淀rna。[1171]通过监测bj成纤维细胞中的环状rna水平来确定在凝胶纯化的环状rna的制剂中不同水平的线性rna对应物的影响。使用基于脂质的转染试剂(赛默飞世尔科技公司(lmrna003))，用凝胶纯化的环状rna制剂、或等量的但补充有不同水平的凝胶纯化线性rna的凝胶纯化的环状rna制剂悬浮(反向)转染96孔板中的细胞。在转染后6小时和1-5天通过q-pcr分析免疫基因水平。简而言之，使用powersybr绿细胞至ct试剂盒(赛默飞世尔科技公司，目录号4402953)并且按照制造商的说明，通过随机引发从细胞裂解物中生成cdna。使用免疫基因特异性引物进行q-pcr，并且使用pfaffl方法和使用β-肌动蛋白作为管家基因计算相对rna水平。[1172]用单独的凝胶纯化的环状rna制剂转染的细胞中的环状rna显示出有限增加的先天性免疫基因表达。相反地，用组合的环状和线性rna转染的细胞以剂量依赖性方式展示出对先天性免疫基因的上调(图15)。[1173]实例25：细胞中合成环状rna的滚环翻译产生离散蛋白质产物[1174]该实例证明在细胞中，经由合成环状rna的滚环翻译翻译出离散蛋白质或免疫原产物，该环状rna缺少终止元件(终止密码子)，例如具有交错元件代替终止元件(终止密码子)。另外，该实例显示，具有交错元件的环状rna比其线性对应物表达更多具有正确分子量的蛋白质或免疫原产物。[1175]将环状rna设计为包括具有交错元件代替终止元件(终止密码子)的纳米荧光素酶基因(nluc)。用以下转染细胞：媒介物：仅转染试剂；线性nluc：emcvires、交错元件(2a序列)、3x带flag标签的nluc序列和交错元件(2a序列)；或环状nluc：emcvires、交错元件(2a序列)、3x带flag标签的nluc序列和交错元件(2a序列)。如图16中所示，与线性rna相比，环状rna产生更高水平的具有正确分子量的蛋白质。[1176]24小时后，通过加入100μlripa缓冲液收获细胞。以1400xg离心5分钟后，在10％-20％梯度聚丙烯酰胺/sds凝胶上分析上清液。[1177]使用干转移法电转移到硝酸纤维素膜上后，将印迹与抗flag抗体和抗小鼠igg过氧化物酶一起孵育。用ecl试剂盒可视化印迹并通过imagej测量蛋白质印迹带强度。[1178]如图16中所示，在细胞中检测到环状rna翻译产物。特别地，不具有终止元件(终止密码子)的环状rna比其线性rna对应物产生更高水平的具有正确分子量的离散蛋白质产物。[1179]实例26：具有调控核酸位点的环状rna的制备[1180]该实例证明具有调控rna结合位点的环状rna的体外产生。[1181]不同的细胞类型拥有独特的核酸调控机制来靶向特定的rna序列。在环状rna中编码这些特定序列可以在不同细胞类型中赋予独特的特性。如以下实例所示，将环状rna工程化以编码微小rna结合位点。[1182]在该实例中，环状rna包括编码wtemcvires的序列、mir692微小rna结合位点和侧接ires-orf的两个间隔元件。[1183]环状rna在体外生成。除了用于驱动转录的t7rna聚合酶启动子外，未修饰的线性rna还从包括以上列出的所有基序的dna模板体外转录。转录的rna用rna清除试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，t2050)纯化，按照制造商的说明用rna5'-磷酸水解酶(rpph)(新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并再次用rna纯化柱纯化。使用长度为10至40个核苷酸的夹板dna和t4rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)将rpph处理的rna环化。将环状rna进行尿素-page纯化(图17)，在缓冲液(0.5m乙酸钠，0.1％sds，1mmedta)中洗脱，乙醇沉淀并且重悬于无rna酶的水中。[1184]如图17中所示，生成了具有mirna结合位点的环状rna。[1185]实例27：用于局部递送的rna配制品[1186]本实例证明用于局部递送的rna配制品。[1187]为了确定rna的局部作用，配制rna用于递送至上皮组织。[1188]如本文所述，根据以下方案用细胞穿透剂配制rna：[1189]10ng包含egforf的线性或环状rna[1190]5μl80％乙醇[1191]35μlpbs+葡萄糖(4.5g/l)[1192]实例28：局部递送环状rna[1193]本实例证明rna的局部递送。[1194]为了确定局部递送效果，配制rna并递送至上皮组织。如本文所述，将rna与细胞穿透剂一起配制并局部递送至耳朵组织。[1195]如实例27配制环状rna样品(50μl)并施加至小鼠的两只耳朵。在将样品施加至耳朵之前，用异丙醇擦拭物擦拭耳朵。通过将耳朵短暂地暴露于灭菌通风橱中的热灯和风扇来干燥耳朵上的样品。在正常条件下将小鼠放回笼中。[1196]在选择的时间点(施加后6小时、1天、3天或12天)，收集每个rna样品的耳朵组织(通过单次耳朵打孔)。[1197]实例29：局部递送后rna的持久性[1198]本实例证明在局部递送后rna的存在。[1199]为了测定rna持久性，分析组织样品中的所递送的rna。如本文所述，分析耳朵打孔样品在rna局部递送后不同时间点的持久性。[1200]在rna稳定试剂中收集来自实例28的耳朵打孔样品和未处理的耳朵打孔样品，并使用标准rna组织提取试剂盒(maxwellrscsimplyrna)提取rna。[1201]向每个样品中添加200μl体积的1-硫代甘油/均化溶液。通过每毫升均化溶液添加20μl1-硫代甘油来制备工作溶液。替代性地，将600μl1-硫代甘油添加到30ml均化溶液瓶中。在使用之前，将1-硫代甘油/均化溶液在冰上或在2-10℃下冷却。[1202]用手持匀浆器和无菌杵将组织样品在200μl经冷却的1-硫代甘油/均化溶液中均化，直到没有可见的组织碎片残留。每个样品再均化15-30秒以完全均化。[1203]为了检查在不同时间点rna的存在，经由q-pcr检查样品中的rna。使用qpcr在耳号钳中测量线性rna和环状rna两者的存在。为了检测扩增的线性和环状rna引物，使用了nlucorf。为了仅检测环状rna，扩增5'-3'接合点的引物可用于检测环状但非线性rna构建体。[1204]在局部递送后6小时、24小时和72小时检测线性和环状rna。在注射后3天，在小鼠耳朵中检测到比线性rna更高水平的环状rna(图18)。[1205]如本实例所示，局部施用的线性和环状rna可在体内检测到。[1206]实例30：局部递送后mrna的蛋白表达[1207]本实例描述了局部递送后蛋白的存在。[1208]为了确定局部递送的rna是否可以被翻译，通过蛋白质印迹分析组织样品在不同时间点的蛋白质或免疫原表达。在局部递送rna后，分析耳朵打孔样品的蛋白表达。[1209]简言之，收集耳朵打孔样品并储存在rna稳定试剂(英杰公司(invitrogen))中。用微量管匀浆器(飞世尔科技公司(fisherscientific))在ripa缓冲液中均化组织并提取蛋白。每个样品以14kxg离心15分钟。[1210]去除上清液，并且将沉淀物在70℃下溶解于2×sds样品缓冲液(0.125mtris-hcl，ph6.8，4％sds，30％甘油，5％2-巯基乙醇，0.01％溴酚蓝)中持续15min。[1211]使用可商购获得的标准品(伯乐公司)作为大小标记物。使用半干法电转移到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜(默克密理博公司)之后，使用化学发光试剂盒(安诺伦公司)可视化印迹。[1212]预期gfp蛋白在耳朵打孔样品中显现，并在环状rna和线性rna中检测到。[1213]实例31：当rna溶液中包含乙醇时，rna的局部施用导致将rna递送至组织。[1214]本实例证明当rna溶液中包含乙醇时，经由体内局部施用将rna递送至细胞和组织。[1215]在本实例中，用emcvires和编码纳米荧光素酶(nluc)的orf设计环状rna。[1216]环状rna在体外生成。从dna模板体外转录未修饰的线性rna。转录的rna用rna纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，t2050)纯化，按照制造商的说明用rna5’磷酸水解酶(rpph)(新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并再次用rna纯化柱纯化。使用长度为10至40个核苷酸的夹板dna和t4rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)将rpph处理的线性rna环化。然后将环状rna进行尿素-page纯化，在缓冲液(0.5m乙酸钠、0.1％sds、1mmedta)中洗脱，经乙醇沉淀并重悬于rna储存溶液(赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific)，目录号am7000)中。在本实例中，环状rna也经hplc纯化。[1217]在本实例中，用编码纳米荧光素酶(nluc)的orf设计线性mrna。在本实例中，通过体外转录在公司内部制备经修饰的线性mrna。在本实例中，线性rna用假尿苷和5-甲基-c完全取代，用包括5'和3'人α-珠蛋白utr的cleancaptmag加帽，并被聚腺苷酸化。[1218]然后将rna在pbs/葡萄糖(4.5g/l)和乙醇(10％v/v)中稀释，使得每个样品的总样品体积为50μl，并且每个样品的总rna为3.5pmol。所有试剂在混合前达到室温，并且在使用之前立即制备混合物。[1219]在时间＝0时，使用移液管尖端将50μl剂量的各样品局部地逐滴施加至balb/c小鼠的耳朵。作为阴性对照，使用未处理的小鼠。通过将耳朵短暂地暴露于灭菌通风橱中的热灯和风扇来干燥样品。在正常条件下将小鼠放回笼中。[1220]为了确定rna在组织中的持久性，在递送后的不同时间点使用rt-qpcr分析组织样品的rna。在施用后6小时、1天、3天和12天，从每只动物取2mm的耳朵打孔样品并储存在rnalater溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7020)中。使用trizol提取从耳朵打孔样品分离总rna。将水相用异丙醇沉淀，并根据制造商的说明用70％etoh洗涤沉淀。从总rna合成cdna并使用nlucorf特异性引物对cdna模板进行rt-pcr。在bio-radcfx384热循环仪上一式三份地测定所有样品。然后将rna水平与肌动蛋白和未处理的阴性对照相对化。[1221]在局部施用后6小时和1天、3天和12天，在组织样品中检测到环状rna和线性rna，并且显示出比仅媒介物对照更大的信号(图19a和图19b)。[1222]本实例证明当用乙醇递送时，环状rna和线性rna经由局部施用成功地递送至组织，并在组织中持续延长的时间段。[1223]实例32：局部施用环状rna导致将rna递送至组织[1224]该实例证明经由体内局部施用将环状rna递送至细胞和组织。[1225]在该实例中，将环状rna设计为具有编码蛋白质或免疫原的orf。在这种情况下，环状rna编码促红细胞生成素蛋白(epo)。[1226]环状rna在体外生成。线性rna在体外从包括上面列出的所有基序的dna模板以及驱动转录的t7rna聚合酶启动子转录。在本实例中，将cy5-utp用于生成cy5标记的rna。转录的rna用rna纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，t2050)纯化，按照制造商的说明用rna5’磷酸水解酶(rpph)(新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并再次用rna纯化柱纯化。使用10至40个核苷酸的夹板dna和t4rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)将rpph处理的线性rna环化。将环状rna进行尿素-page纯化，在缓冲液(0.5m乙酸钠、0.1％sds、1mmedta)中洗脱，经乙醇沉淀并重悬于rna储存溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7000)中。[1227]将环状rna在具有5％乙醇的pbs/葡萄糖(4.5g/l)中稀释，使得每个样品的总样品体积为25μl，并且每个样品的总rna为12皮摩尔。所有试剂在混合前达到室温，并且在使用之前立即制备混合物。[1228]在时间＝0时，用异丙醇擦拭物擦拭小鼠的耳朵，干燥并使用移液管尖端将25μl剂量的各样品局部地逐滴施加至balb/c小鼠的耳朵。通过将耳朵短暂地暴露于灭菌通风橱中的热灯和风扇来干燥样品。在正常条件下将小鼠放回笼中。[1229]为了确定环状rna向组织的递送，在施用后的不同时间点通过荧光显微镜分析组织样品。在施用后6小时、1天和3天，从每只动物取2mm的耳朵打孔样品并储存在冰冷的pbs中。然后在evosii荧光显微镜下观察组织样品。然后使用imagej量化图像的荧光。[1230]在局部施用后6小时、1天和3天，在组织样品中检测到cy5信号，并显示出比未显示任何荧光的阴性对照更大的信号(图20和图21)。这表明环状rna被成功递送至组织。[1231]本实例证明环状rna经由局部施用成功地递送，并在组织中持续延长的时间段。[1232]实例33：向鼻粘膜上皮局部施用未修饰的rna导致rna在组织中的长期存在。[1233]该实例描述经由局部施用将未修饰的rna递送至鼻粘膜上皮并经由局部施用实现线性和环状rna摄取。[1234]对于本实例，rna中包括ires、编码纳米荧光素酶(nluc)的orf和侧接ires-orf的两个间隔元件。[1235]环状rna在体外生成。未修饰的线性rna在体外从包括上面列出的所有基序的dna模板以及驱动转录的t7rna聚合酶启动子转录。转录的rna用rna纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，t2050)纯化，按照制造商的说明用rna5’磷酸水解酶(rpph)(新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并再次用rna纯化柱纯化。使用长度为10至40个核苷酸的夹板dna和t4rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)将rpph处理的线性rna环化。将环状rna进行尿素-page纯化，在缓冲液(0.5m乙酸钠、0.1％sds、1mmedta)中洗脱，经乙醇沉淀并重悬于rnaa储存溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7000)中。生成线性rna对应物，其包括上述相同的nlucorf和编码组件。[1236]将rna稀释至1pmol/μl的浓度。将柠檬酸盐缓冲液中的5pmolrna与无菌pbs合并。每次施加所用的总样品体积为20μl。类似地制备仅媒介物对照样品，但不含rna。所有试剂在混合前达到室温，并且在使用之前立即制备混合物。[1237]在灭菌通风橱中，将小鼠通过其耳朵置于悬挂位置。在时间＝0时，使用微量移液管将20μl剂量的各样品逐渐释放到balb/c小鼠的鼻孔中(每个鼻孔10μl)。在施加过程中将嘴和另一鼻孔闭上以确保摄取。将小鼠保持在悬挂位置，直到呼吸速率恢复正常。在正常条件下将小鼠放回笼中。[1238]在施用后6、24和48小时，处死小鼠并从小鼠获取鼻组织。将每个组织样品(～2mg)置于200μl冷却的1-硫代甘油/均化溶液中，并使用手持式匀浆器和无菌杵均化直至没有可见的组织碎片残留。每个样品再均化15-30秒以完全均化。[1239]为了确定rna在组织中的持久性，在递送后的不同时间点使用qpcr分析组织样品的rna。使用qpcr测量提取的组织中的线性rna和环状rna两者。使用扩增nlucorf的引物。为了仅检测环状rna，扩增5’‑3’接合点的引物允许检测环状而非线性rna构建体。[1240]实例34：当在施加前用乙醇擦拭物擦拭组织时，环状rna的局部施用导致将rna递送至组织。[1241]该实例证明经由体内局部施用将未经修饰的环状rna递送至细胞和组织。[1242]在本实例中，用ires和编码纳米荧光素酶(nluc)的orf设计环状rna。[1243]环状rna在体外生成。未修饰的线性rna从包括上面列出的所有基序的dna模板以及用于驱动转录的t7rna聚合酶启动子体外转录。转录的rna用rna纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，t2050)纯化，按照制造商的说明用rna5’磷酸水解酶(rpph)(新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并再次用rna纯化柱纯化。使用长度具有10至40个核苷酸的夹板dna和t4rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)将rpph处理的线性rna环化。将环状rna进行尿素-page纯化，在缓冲液(0.5m乙酸钠、0.1％sds、1mmedta)中洗脱，经乙醇沉淀并重悬于rna储存溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7000)中。[1244]然后将rna用仅pbs或用pbs+10％(v/v)乙醇稀释，使得每个样品的总样品体积为35μl，并且每个样品的总rna为20pmol。作为阴性对照，如上所述制备仅媒介物对照，但不含rna。所有试剂在混合前达到室温，并且在使用之前立即制备混合物。[1245]在时间＝0时，用乙醇擦拭物擦拭小鼠的耳朵，干燥并使用移液管尖端将35μl剂量的各样品局部地逐滴施加至balb/c小鼠的耳朵。通过将耳朵短暂地暴露于灭菌通风橱中的热灯和风扇来干燥样品。在正常条件下将小鼠放回笼中。[1246]为了确定rna在组织中的持久性，在递送后的不同时间点使用rt-qpcr分析组织样品的rna。在施用后1天和4天，从每只动物取2mm的耳朵打孔样品并储存在rnalater溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7020)中。通过以下方式从耳朵打孔样品分离总rna：在液氮中快速冷却并用玻璃研钵和杵均化，然后进行trizol提取(赛默飞世尔科技公司，目录号15596026)。将水相用异丙醇沉淀，并根据制造商的说明用70％etoh洗涤沉淀。使用superscriptiv(赛默科技公司(thermoscientific)，目录号11766500)从总rna合成cdna。使用itaqtm通用绿色超混合液(伯乐公司(bio-rad)，目录号1725124)和nlucorf特异性引物对cdna模板进行rt-pcr。在bio-radcfx384热循环仪上一式三份地测定所有样品。然后将rna水平与管家基因(28s)相对化。[1247]在用乙醇擦拭物擦拭皮肤再局部施用后，对于仅pbs中的环状rna在第1天和第4天以及对于pbs+10％etoh中的rna在第1天在组织样品中检测到环状rna，并且显示出比相关的仅媒介物对照更大的信号(图22)。[1248]本实例证明当在施用前用乙醇擦拭物擦拭皮肤时，环状rna经由局部施用成功递送，并在组织中持续延长的时间段。[1249]实例35：当在施加前用异丙醇擦拭物擦拭组织时，环状rna的局部施用导致将rna递送至组织。[1250]该实例证明经由体内局部施用将未经修饰的环状rna递送至细胞和组织。[1251]在本实例中，用ires和编码纳米荧光素酶(nluc)的orf设计环状rna。[1252]环状rna在体外生成。未修饰的线性rna从包括上面列出的所有基序的dna模板以及用于驱动转录的t7rna聚合酶启动子体外转录。转录的rna用rna纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，t2050)纯化，按照制造商的说明用rna5’磷酸水解酶(rpph)(新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并再次用rna纯化柱纯化。使用长度为10至40个核苷酸的夹板dna和t4rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)将rpph处理的线性rna环化。将环状rna进行尿素-page纯化，在缓冲液(0.5m乙酸钠、0.1％sds、1mmedta)中洗脱，经乙醇沉淀并重悬于rna储存溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7000)中。[1253]然后将rna用仅pbs稀释，使得每个样品的总样品体积为35μl，并且每个样品的总rna为20pmol。作为阴性对照，如上所述制备仅媒介物对照，但不含rna。所有试剂在混合前达到室温，并且在使用之前立即制备混合物。[1254]在时间＝0时，用异丙醇擦拭物(cvs，297584)擦拭小鼠的耳朵，干燥并使用移液管尖端将35μl剂量的各样品局部地逐滴施加至balb/c小鼠的耳朵。作为阴性对照，使用仅异丙醇擦拭。通过将耳朵短暂地暴露于灭菌通风橱中的热灯和风扇来干燥样品。在正常条件下将小鼠放回笼中。[1255]为了确定rna在组织中的持久性，在递送后的不同时间点使用rt-qpcr分析组织样品的rna。在施用后1天和4天，从每只动物取2mm的耳朵打孔样品并储存在rnalater溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7020)中。通过以下方式从耳朵打孔样品分离总rna：在液氮中快速冷却并用玻璃研钵和杵均化，然后进行trizol提取(赛默飞世尔科技公司，目录号15596026)。将水相用异丙醇沉淀，并根据制造商的说明用70％etoh洗涤沉淀。使用superscriptiv(赛默科技公司，目录号11766500)从总rna合成cdna。使用itaqtm通用绿色超混合液(伯乐公司(bio-rad)，目录号1725124)和nlucorf特异性引物对cdna模板进行rt-pcr。在bio-radcfx384热循环仪上一式三份地测定所有样品。然后将rna水平与管家基因(28s)相对化。[1256]在局部施用后1天和4天时在组织样品中检测到环状rna，并且显示出比仅媒介物对照更大的信号(图23)。[1257]本实例证明在用异丙醇擦拭物擦拭皮肤后，环状rna经由局部施用成功地递送至组织，并在组织中持续延长的时间段。[1258]实例36：局部施用环状rna导致组织中的蛋白表达[1259]本实例证明经由体内局部施用将未修饰的环状rna递送至细胞和组织并实现随后的蛋白表达。[1260]在本实例中，用ires和编码纳米荧光素酶(nluc)的orf设计环状rna。[1261]环状rna在体外生成。未修饰的线性rna从包括上面列出的所有基序的dna模板以及用于驱动转录的t7rna聚合酶启动子体外转录。转录的rna用rna纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，t2050)纯化，按照制造商的说明用rna5’磷酸水解酶(rpph)(新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并再次用rna纯化柱纯化。使用长度为10至40个核苷酸的夹板dna和t4rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)将rpph处理的线性rna环化。将环状rna进行尿素-page纯化，在缓冲液(0.5m乙酸钠、0.1％sds、1mmedta)中洗脱，经乙醇沉淀并重悬于rna储存溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7000)中。[1262]然后将rna用pbs+10％(v/v)乙醇稀释，使得每个样品的总样品体积为35μl，并且每个样品的总rna为20pmol。作为阴性对照，如上所述制备仅媒介物对照，但不含rna。所有试剂在混合前达到室温，并且在使用之前立即制备混合物。[1263]在时间＝0时，使用移液管尖端将35μl剂量的各样品局部地逐滴施加至balb/c小鼠的耳朵。通过将耳朵短暂地暴露于灭菌通风橱中的热灯和风扇来干燥样品。在正常条件下将小鼠放回笼中。[1264]为了测定组织中的rna表达，在局部递送后的不同时间点分析组织样品的nluc活性。在递送后4天时从小鼠获取耳朵打孔样品。将每个组织样品压碎成碎片并置于具有1x蛋白酶抑制剂混合物(proteaseinhibitorcocktail)的50μl冰冷nluc裂解测定缓冲液(lysisassaybuffer)中并置于冰上。然后将样品在定轨振荡器上以700rpm孵育5分钟，然后在室温下离心以除去组织碎片。然后将50μl上清液转移到新试管中而不扰动组织沉淀物。将50μl各样品转移到96孔板中，并根据制造商的说明进行nano-glo荧光素酶测定系统(普洛麦格公司，#n1110)测定。简言之，向各孔中添加1μlfurimazine底物和49μlpbs并混合。添加底物并混合后，将板孵育10分钟，然后在光度计仪器(普洛麦格公司)中读数。[1265]对于pbs+10％乙醇(v/v)中的环状rna，在局部施用后4天，在组织样品中检测到纳米荧光素酶活性，并且观察到高于相关的仅媒介物对照(图24)。[1266]本实例证明环状rna经由局部施用成功递送，并且能够长时间表达可在组织中检测到的功能性蛋白。[1267]实例37：当在施加前用聚维酮碘擦拭组织时，环状rna的局部施用导致将rna递送至组织。[1268]该实例描述经由体内局部施用将未经修饰的环状rna递送至细胞和组织。[1269]在本实例中，用ires和编码纳米荧光素酶(nluc)的orf设计环状rna。[1270]环状rna在体外生成。未修饰的线性rna在体外从包括上面列出的所有基序的dna模板以及驱动转录的t7rna聚合酶启动子转录。转录的rna用rna纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，t2050)纯化，按照制造商的说明用rna5’磷酸水解酶(rpph)(新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并再次用rna纯化柱纯化。使用长度为10至40个核苷酸的夹板dna和t4rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)将rpph处理的线性rna环化。将环状rna进行尿素-page纯化，在缓冲液(0.5m乙酸钠、0.1％sds、1mmedta)中洗脱，经乙醇沉淀并重悬于rna储存溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7000)中。[1271]然后将rna用仅pbs稀释，使得每个样品的总样品体积为35μl，并且每个样品的总rna为20pmol。作为阴性对照，如上所述制备仅媒介物对照，但不含rna。所有试剂在混合前达到室温，并且在使用之前立即制备混合物。[1272]在时间＝0时，用作为灭菌剂的商业聚维酮碘(10％)擦拭小鼠的耳朵。用无菌棉拭子除去过量的聚维酮碘，并使用移液管尖端将35μl剂量的各样品局部地逐滴施加至balb/c小鼠的耳朵。通过将耳朵短暂地暴露于灭菌通风橱中的热灯和风扇来干燥样品。在正常条件下将小鼠放回笼中。[1273]为了确定rna在组织中的持久性，在递送后的不同时间点使用rt-qpcr分析组织样品的rna。在施用后1天和4天，从每只动物取2mm的耳朵打孔样品并储存在rnalater溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7020)中。通过以下方式从耳朵打孔样品分离总rna：在液氮中快速冷却并用玻璃研钵和杵均化，然后进行trizol提取(赛默飞世尔科技公司，目录号15596026)。将水相用异丙醇沉淀，并根据制造商的说明用70％etoh洗涤沉淀。使用superscriptiv(赛默科技公司，目录号11766500)从总rna合成cdna。使用itaqtm通用绿色超混合液(伯乐公司(bio-rad)，目录号1725124)和nlucorf特异性引物对cdna模板进行rt-pcr。在bio-radcfx384热循环仪上一式三份地测定所有样品。然后将rna水平与管家基因(28s)相对化。[1274]实例38：当在施加前用过氧化氢喷雾喷洒组织时，局部施用环状rna导致将rna递送至组织。[1275]该实例描述经由体内局部施用将未经修饰的环状rna递送至细胞和组织。[1276]在本实例中，用ires和编码纳米荧光素酶(nluc)的orf设计环状rna。[1277]环状rna在体外生成。未修饰的线性rna在体外从包括上面列出的所有基序的dna模板以及驱动转录的t7rna聚合酶启动子转录。转录的rna用rna纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，t2050)纯化，按照制造商的说明用rna5’磷酸水解酶(rpph)(新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并再次用rna纯化柱纯化。使用长度为10至40个核苷酸的夹板dna和t4rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)将rpph处理的线性rna环化。将环状rna进行尿素-page纯化，在缓冲液(0.5m乙酸钠、0.1％sds、1mmedta)中洗脱，经乙醇沉淀并重悬于rna储存溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7000)中。[1278]然后将rna用仅pbs稀释，使得每个样品的总样品体积为35μl，并且每个样品的总rna为20pmol。作为阴性对照，如上所述制备仅媒介物对照，但不含rna。所有试剂在混合前达到室温，并且在使用之前立即制备混合物。[1279]在时间＝0时，用作为灭菌剂的市售过氧化氢(3％)喷洒小鼠的耳朵，用无菌棉拭子干燥并使用移液管尖端将35μl剂量的各样品局部地逐滴施加至balb/c小鼠的耳朵。通过将耳朵短暂地暴露于灭菌通风橱中的热灯和风扇来干燥样品。在正常条件下将小鼠放回笼中。[1280]为了确定rna在组织中的持久性，在递送后的不同时间点使用rt-qpcr分析组织样品的rna。在施用后1天和4天，从每只动物取2mm的耳朵打孔样品并储存在rnalater溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7020)中。通过以下方式从耳朵打孔样品分离总rna：在液氮中快速冷却并用玻璃研钵和杵均化，然后进行trizol提取(赛默飞世尔科技公司，目录号15596026)。将水相用异丙醇沉淀，并根据制造商的说明用70％etoh洗涤沉淀。使用superscriptiv(赛默科技公司，目录号11766500)从总rna合成cdna。使用itaqtm通用绿色超混合液(伯乐公司(bio-rad)，目录号1725124)和nlucorf特异性引物对cdna模板进行rt-pcr。在bio-radcfx384热循环仪上一式三份地测定所有样品。然后将rna水平与管家基因(28s)相对化。[1281]实例39：检测血液中的分泌型免疫原[1282]通过亚摩尔抽吸从每只小鼠收集血样(～25μl)进行分析。在环状rna给药后0小时、6小时、24小时、48小时和7天，将血液收集到edta试管中。通过在4℃下以1300g离心30分钟来分离血浆。使用elisa或蛋白质印迹评估分泌型免疫原的表达，例如对于rbd免疫原而言，使用如实例14中所述的方法。[1283]实例40：免疫原抗体的检测[1284]该实例描述了如何确定免疫原抗体的存在。[1285]如chenx等人所述使用elisa(medrxiv,doi:doi.org/10.1101/2020.04.06.20055475(2020))。简言之，将每孔100μlpbs中的sars-cov-2蛋白于4℃包被在elisa板上过夜。然后用封闭缓冲液(5％fbs加上0.05％吐温20)将elisa板封闭1小时。然后在1小时内将10倍稀释的血浆添加到每个孔的100μl封闭缓冲液中。用含洗涤剂的1x磷酸盐缓冲液(pbst)洗涤后，将结合的抗体与抗小鼠igghrp检测抗体(英杰公司)一起孵育30分钟，接着用pbst洗涤，然后用pbs洗涤，并添加四甲基苯。使elisa板反应5分钟，然后使用1mhcl终止缓冲液淬灭。在450nm下测定光密度(od)值。[1286]a.对于sars-cov-2rbd免疫原的抗体，所用的sars-cov-2蛋白质是sars-cov-2rbd(义翘神州生物技术有限公司，40592-v08b)。[1287]b.对于sars-cov-2刺突免疫原的抗体，所用的sars-cov-2蛋白质是sars-cov-2刺突蛋白(义翘神州生物技术有限公司，40591-v08h)。[1288]实例41：环状rna的蛋白质表达增加[1289]该实例证明细胞中的合成环状rna翻译。另外，该实例显示，环状rna比其线性对应物产生更多具有正确分子量的表达产物。[1290]将线性rna和环状rna设计为包括具有终止元件(终止密码子)的纳米荧光素酶基因(nluc)。用以下转染细胞：媒介物：仅转染试剂；线性nluc：emcvires、交错元件(2a序列)、3x带flag标签的nluc序列、交错元件(2a序列)和终止元件(终止密码子)；或环状nluc：emcvires、交错元件(2a序列)、3x带flag标签的nluc序列、交错元件(2a序列)和终止元件(终止密码子)。如图25所示，与线性rna相比，环状rna产生更高水平的具有正确分子量的蛋白质。[1291]24小时后，通过加入100μlripa缓冲液收获细胞。以1400xg离心5分钟后，在10％-20％梯度聚丙烯酰胺/sds凝胶上分析上清液。[1292]使用干转移法电转移到硝酸纤维素膜上后，将印迹与抗flag抗体和抗小鼠igg过氧化物酶一起孵育。用ecl试剂盒可视化印迹并通过imagej测量蛋白质印迹带强度。[1293]如图25所示，环状rna在细胞中被翻译成蛋白质。特别地，环状rna比其线性rna对应物产生更高水平的具有正确分子量的蛋白质。[1294]实例42：环状rna的体内再给药[1295]该实例证明了使用两剂环状rna驱动体内环状rna表达的能力。[1296]对于该实例，环状rna包括emcvires、编码高斯荧光素酶(gluc)的orf和侧接ires-orf的两个间隔元件。[1297]环状rna在体外生成。未修饰的线性rna从包括以上列出的所有基序以及用于驱动转录的t7rna聚合酶启动子的dna模板体外转录。转录的rna用monarchrna清除试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，t2050)纯化，按照制造商的说明用rna5'-磷酸水解酶(rpph，新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并再次用monarchrna清除系统纯化。使用长度为10至40个核苷酸的夹板dna和t4rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)将rpph处理的rna环化。将环状rna进行尿素-page纯化，在缓冲液(0.5m乙酸钠、0.1％sds、1mmedta)中洗脱，经乙醇沉淀并重悬于rna储存溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7000)中。[1298]小鼠在第0天接受单剂尾静脉注射0.25μg具有高斯荧光素酶orf的环状rna，或作为对照的线性rna，二者均在作为载剂的基于脂质的转染试剂(米卢斯(mirus))中配制，第56天施用第二剂。[1299]在给药后1、2、7、11、16和23天，收集每只小鼠的尾静脉血样(50μl)到edta管中。通过在4℃下以1300g离心25分钟分离血浆，并使用高斯荧光素酶活性测定法(赛默科技皮尔斯公司)测试了高斯荧光素酶(一种分泌酶)的活性。将50μl1xgluc底物添加到5μl血浆中，以进行gluc荧光素酶活性测定。在发光检测仪(普洛麦格公司)中混合后立即读取平板。[1300]在第一剂环状rna给药后1、2、7、11、16和23天，在血浆中检测到高斯荧光素酶活性(图26)。[1301]相反，仅在经修饰的线性rna给药后1和2天在血浆中检测到高斯荧光素酶活性(图26)。[1302]在第二剂环状rna给药后2、3、8和15天再次在血浆中检测到高斯荧光素酶活性(图26)。[1303]相反，仅在经修饰的线性rna给药后1、2、3天在血浆中检测到高斯荧光素酶活性。[1304]该实例证明环状rna在更长时间段中体内表达蛋白质，以及在注射后数天血浆中的蛋白质活性水平。另外，证明环状rna的再给药产生了相似的表达谱。[1305]实例43：环状rna的体内交错给药[1306]该实例证明了使用连续交错剂量的环状rna驱动体内环状rna更高表达蛋白质或免疫原的能力。[1307]对于该实例，环状rna包括emcvires、编码高斯荧光素酶(gluc)的orf和侧接ires-orf的两个间隔元件。[1308]环状rna在体外生成。未修饰的线性rna从包括以上列出的所有基序以及用于驱动转录的t7rna聚合酶启动子的dna模板体外转录。转录的rna用rna清除试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，t2050)纯化，按照制造商的说明用rna5'-磷酸水解酶(rpph)(新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并再次用rna纯化柱纯化。使用长度为10至40个核苷酸的夹板dna和t4rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)将rpph处理的rna环化。将环状rna进行尿素-page纯化，在缓冲液(0.5m乙酸钠，0.1％sds，1mmedta)中洗脱，经乙醇沉淀并重悬于无rna酶的水中。[1309]在第0天、第2天和第5天，小鼠接受一剂尾静脉注射0.25pmol具有高斯荧光素酶orf的环状rna，或作为对照的线性rna，二者均在作为载剂的基于脂质的转染试剂(米卢斯)中配制。[1310]在给药后6小时、1、2、3、5、7、14、21、28、35、42天，从每只小鼠的尾静脉中收集血样(50μl)到edta管中。通过在4℃下以1300g离心25分钟分离血浆，并使用高斯荧光素酶活性测定法(赛默科技皮尔斯公司)测试了高斯荧光素酶(一种分泌酶)的活性。将50μl1xgluc底物添加到5μl血浆中，以进行gluc荧光素酶活性测定。在发光检测仪(普洛麦格公司)中混合后立即读取平板。[1311]在单剂环状rna给药后6小时、1、2、3、5、7、14、21、28天，在血浆中检测到高斯荧光素酶活性(图27和图28)。当给药3个剂量时，在第一剂环状rna给药后6小时、1、2、3、5、7、14、21、28、35天，在血浆中检测到高斯荧光素酶活性(图27和图28)。[1312]相反，仅在经修饰的线性rna给药后6小时、1、2、3天在血浆中检测到高斯荧光素酶活性并且表达水平不会增加超过其初始剂量。即使另外的线性rna给药，在第x天或之后仍未检测到高于本底水平的来自线性rna来源的蛋白质的酶活性(图27和图28)。[1313]该实例证明环状rna在更长时间段中体内表达蛋白质，在多次注射后血浆中的蛋白质活性水平增加。另外，证明环状rna而不是线性rna的重复给药引起表达。[1314]实例44：经由肌内注射裸剂量和重复剂量(redose)的环状rna[1315]该实例证明了使用两剂肌内施用的环状rna驱动体内环状rna表达蛋白质或免疫原的能力。[1316]对于该实例，环状rna包括emcvires、编码高斯荧光素酶(gluc)的orf和侧接ires-orf的两个间隔元件。[1317]根据本文所述的方法生成环状rna和mrna。[1318]为了生成未配制的rna，然后将环状rna和mrna在100μlpbs中稀释到2.5皮摩尔的最终浓度。[1319]小鼠接受向后腿单次肌内注射2.5皮摩尔的具有高斯荧光素酶orf的环状rna。在第0天进行注射，并在第49天施用第二剂。使用仅媒介物作为对照。[1320]在给药后1、2、7、11、16和23天，通过颏下穿刺将血样(50μl)收集到edta管中。通过在4℃下以1300g离心25分钟分离血浆，并使用高斯荧光素酶活性测定法(赛默科技皮尔斯公司)测试了高斯荧光素酶(一种分泌酶)的活性。将50μl1xgluc底物添加到5μl血浆中，以进行gluc荧光素酶活性测定。在发光检测仪(普洛麦格公司)中混合后立即读取平板。[1321]在第一剂未配制的环状rna给药后1、2、7、11、16和23天，在血浆中检测到高斯荧光素酶活性。(图29)[1322]相反，仅在未配制的mrna给药后1和2天在血浆中检测到高斯荧光素酶活性。(图29)[1323]在第二剂未配制的环状rna给药后2、3、8和15天再次在血浆中检测到高斯荧光素酶活性。(图29)[1324]相反，仅在未配制的经修饰的mrna给药后1、2和3天在血浆中检测到高斯荧光素酶活性。(图29)[1325]在每种情况下，高斯荧光素酶活性高于仅媒介物的对照。[1326]该实例证明无载剂的肌内施用的环状rna在更长时间段中体内表达蛋白质，以及在注射后数天血浆中的蛋白质活性水平。另外，证明环状rna的再给药产生了相似的表达谱。[1327]实例45：静脉内重复注射五次载剂重复剂量的环状rna引起功能性蛋白质的表达[1328]该实例证明了使用五剂静脉内施用的环状rna驱动体内环状rna表达的能力。[1329]对于该实例，环状rna包括emcvires、编码高斯荧光素酶(gluc)的orf和侧接ires-orf的两个间隔元件。[1330]根据本文所述的方法生成环状rna和mrna。[1331]使用阳离子脂质载剂配制环状rna和mrna。在该实例中，根据制造商的说明，将10％transit(米卢斯生物公司)和5％增进剂与rna复合。[1332]小鼠接受0.25皮摩尔包括高斯荧光素酶orf的环状rna的单尾静脉注射剂量。在第0天、第71天、第120天、第196天和第359天进行注射。使用仅媒介物作为对照。[1333]在给药后0.25、1、2、3、7、14、21、28和35天，通过颏下穿刺将血样(50μl)收集到edta管中。通过在4℃下以1300g离心25分钟分离血浆，并使用高斯荧光素酶活性测定法(赛默科技皮尔斯公司)测试了高斯荧光素酶(一种分泌酶)的活性。将50μl1xgluc底物添加到5μl血浆中，以进行gluc荧光素酶活性测定。在发光检测仪(普洛麦格公司)中混合后立即读取平板。[1334]当用trans-it配制的环状rna给药时，在以下时间点在血浆中检测到高斯荧光素酶活性：第一剂给药后第1、2、3、7、14、21和28天；第二剂给药后第1、2、3、7、14和21天；第三剂给药后第1、2、3、7、14和21天；第四剂给药后第1、2、3、7、14、21和28天；以及，第五剂给药后第1、2、3、7、14和21天。(图30)[1335]相反，当用trans-it配制的经修饰的mrna给药时，在以下时间点在血浆中检测到高斯荧光素酶活性：第一剂给药后第0.25、1和2天；第二剂给药后第0.25、1和2天；第三剂给药后第0.25、1和2天；第四剂给药后第0.25、1和2天；以及，第五剂给药后第0.25、1和2天。(图30)[1336]在每种情况下，环状rna的高斯荧光素酶活性高于mrna并且因此表达也高于mrna。[1337]该实例证明静脉内施用的环状rna在更长时间段中在体内表达蛋白质，以及在注射后数天血浆中的蛋白质活性水平，并且可以再给药至少5次。另外，证明环状rna长期再给药产生了相似的表达谱。[1338]实例46：在哺乳动物细胞中由环状rna表达多种免疫原[1339]该实例证明在哺乳动物细胞中由环状rna表达多种免疫原。[1340]实验1[1341]根据本文所述的方法设计并纯化编码包括n端gluc信号序列的sars-cov-2rbd免疫原的第一环状rna(核酸seqidno:33；氨基酸seqidno:32)和编码sars-cov-2刺突免疫原的第二环状rna(核酸seqidno:31；氨基酸seqidno:30)。将第一环状rna和第二环状rna混合在一起以获得混合物。使用lipofectaminemessengermax(赛默飞世尔公司，lmrna015)将混合物(各1皮摩尔的环状rna)转染到hela细胞(24孔板中每孔100,000个细胞)中。作为对照，使用messengermax也将第一环状rna和第二环状rna单独转染到hela细胞中。[1342]在24小时时使用sars-cov-2rbd免疫原特异性elisa测量rbd免疫原的表达。在24小时时通过流式细胞术测量刺突免疫原的表达。[1343]通过用该混合物转染，在hela细胞上清液中检测到sars-co-v-2rbd免疫原，并且在hela细胞的细胞表面检测到sars-cov-2刺突免疫原。通过用第一环状rna转染，检测到sars-cov-2rbd免疫原，但未检测到sars-cov-2刺突免疫原。通过用第二环状rna转染，检测到sars-cov-2刺突免疫原，但未检测到sars-cov-2rbd免疫原。这证明在哺乳动物细胞中由环状rna的组合混合物表达sar-cov-2rbd和sars-cov-2刺突免疫原两者。[1344]实验2[1345]根据本文所述的方法设计并生产编码包括n端高斯荧光素酶(gluc)信号序列的sars-cov-2rbd免疫原的第一环状rna(核酸seqidno:33；氨基酸seqidno:32)和编码gluc多肽的第二环状rna(核酸seqidno:37；氨基酸seqidno:36)。将第一环状rna和第二环状rna单独与lipofectaminemessengermax(赛默飞世尔公司，lmrna015)复合，然后混合在一起以获得混合物。将混合物(各0.1皮摩尔的环状rna)转染到hela细胞(96孔板中每孔20,000个细胞)中。作为对照，使用messengermax也将第一环状rna和第二环状rna单独转染到hela细胞中。[1346]在24小时时使用sars-cov-2rbd免疫原特异性elisa测量rbd免疫原的表达。在24小时时使用高斯荧光素酶活性测定法(赛默科技皮尔斯公司)测量gluc活性。[1347]通过用该混合物转染，在24小时时在hela细胞上清液中检测到sars-cov-2rbd免疫原和gluc活性。通过用第一环状rna转染，检测到sars-cov-2rbd免疫原，但未检测到gluc活性。通过用第二环状rna转染，检测到gluc活性，但未检测到sars-cov-2rbd免疫原。这证明在哺乳动物细胞中由环状rna的组合混合物表达sar-cov-2rbd和gluc免疫原两者。[1348]实验3[1349]根据本文所述的方法设计并生产编码包括n端gluc信号序列的sars-cov-2rbd免疫原的第一环状rna(核酸seqidno:33；氨基酸seqidno:32)和编码来自甲型h1n1流感a/加利福利亚/07/2009的血凝素(ha)免疫原的第二环状rna(核酸seqidno:35；氨基酸seqidno:34)。将第一环状rna和第二环状rna混合在一起以获得混合物。使用lipofectaminemessengermax(赛默飞世尔公司，lmrna015)将混合物(各1皮摩尔的环状rna)转染到hela细胞(24孔板中每孔100,000个细胞)中。作为对照，使用messengermax也将第一环状rna和第二环状rna单独转染到hela细胞中。[1350]在24小时时使用sars-cov-2rbd免疫原特异性elisa测量rbd免疫原的表达。在24小时时使用免疫印迹法测量ha免疫原表达。简言之，对于免疫印迹法，在转染后24小时，裂解细胞并使用甲型流感h1n1ha(a/加利福利亚/07/2009)单克隆抗体(ma5-29920(赛默飞世尔公司))作为一抗并使用山羊抗小鼠iggh&l(hrp)作为二抗(艾博抗公司(abcam)，ab97023)进行蛋白质印迹法以检测ha免疫原。为了负载对照，将α微管蛋白与作为一抗的α微管蛋白(dm1a)小鼠抗体(细胞信号传导技术公司(cellsignalingtechnology)，cst#3873)和作为二抗的山羊抗小鼠iggh&l(hrp)(艾博抗公司，ab97023)一起使用。[1351]通过用混合物转染，检测到sars-cov-2rbd和流感ha免疫原两者。通过用第一环状rna转染，检测到sars-cov-2rbd，但未检测到流感ha免疫原。通过用第二环状rna转染，检测到流感ha免疫原，但未检测到sars-cov-2rbd免疫原。这证明在哺乳动物细胞中由环状rna的组合混合物表达sar-cov-2rbd和流感ha免疫原两者。[1352]实验4[1353]根据本文所述的方法设计并生产编码sars-cov-2刺突免疫原的第一环状rna(核酸seqidno:31；氨基酸seqidno:30)和编码来自甲型h1n1流感a/加利福利亚/07/2009的血凝素(ha)的第二环状rna(核酸seqidno:35；氨基酸seqidno:34)。将第一环状rna和第二环状rna混合在一起以获得混合物。使用lipofectaminemessengermax(赛默飞世尔公司，lmrna015)将混合物(各1皮摩尔的环状rna)转染到hela细胞(24孔板中每孔100,000个细胞)中。作为对照，使用messengermax也将第一环状rna和第二环状rna单独转染到hela细胞中。[1354]在24小时时通过流式细胞术测量刺突免疫原的表达。如上文实验3中所述，在24小时时通过免疫印迹法测量ha免疫原表达。[1355]通过用混合物转染，检测到sars-cov-2刺突免疫原和流感ha免疫原两者。通过用第一环状rna转染，检测到sars-cov-2刺突免疫原，但未检测到流感ha免疫原。通过用第二环状rna转染，检测到流感ha免疫原，但未检测到sars-cov-2刺突免疫原。这证明在哺乳动物细胞中由环状rna的组合混合物表达sar-cov-2刺突和流感ha免疫原两者。[1356]该实例显示，在哺乳动物细胞中从包含环状rna的不同组合的环状rna制剂表达了多种免疫原。[1357]实例47：环状rna的多免疫原表达[1358]该实例证明在哺乳动物细胞中由环状rna表达多种免疫原。[1359]实验1[1360]在该实例中，将环状rna设计成包括ires，其后是编码gluc多肽的orf、终止密码子、间隔子、ires、编码sars-cov-2rbd免疫原的orf和终止密码子。根据本文所述的方法产生并纯化环状rna。作为对照，如上所述产生以下环状rna：(i)具有ires和编码sars-cov-2rbd免疫原的orf的环状rna；(ii)具有ires和编码gluc多肽的orf的环状rna。[1361]使用lipofectaminemessengermax(赛默飞世尔公司，lmrna015)将环状rna(0.1皮摩尔)转染到hela细胞(96孔板中每孔10,000个细胞)中。[1362]在24小时时使用sars-cov-2rbd免疫原特异性elisa测量rbd免疫原的表达。在24小时时使用高斯荧光素酶活性测定法(赛默科技皮尔斯公司)测量gluc活性。[1363]从编码sarss-cov-2rbd免疫原和gluc多肽的环状rna中检测到rbd免疫原表达(图31a)。从编码sarss-cov-2rbd免疫原和gluc的环状rna中检测到gluc活性(图31b)。这证明哺乳动物细胞中从编码sars-cov-2rbd和gluc免疫原的环状rna表达sar-cov-2rbd和gluc免疫原。[1364]实验2[1365]在该实例中，将环状rna设计为包括ires，其后是编码sars-cov-2rbd免疫原的orf、终止密码子、间隔子、ires、编码中东呼吸综合征(mers)rbd免疫原的orf和终止密码子。根据本文所述的方法产生并纯化环状rna。[1366]使用lipofectaminemessengermax(赛默飞世尔公司，lmrna015)以各种浓度将环状rna转染到hela细胞(96孔板中每孔10,000个细胞)中。[1367]在24小时时使用sars-cov-2rbd免疫原特异性elisa测量sars-cov-2rbd免疫原的表达。在24小时时使用能够检测的mersrbd免疫原特异性抗体测量mersrbd免疫原表达。[1368]实例48：小鼠模型中来自环状rna的多种免疫原的免疫原性[1369]该实例描述了通过施用多个环状rna分子在受试者中表达多种免疫原。[1370]实验1[1371]在小鼠模型中评价配制于脂质纳米颗粒中的环状rna制剂的免疫原性，该环状rna制剂包含(a)编码sars-cov-2rbd免疫原的环状rna以及(b)编码多肽作为模型免疫原的gluc多肽的环状rna。还在小鼠模型中评价了针对sars-cov-2rbd免疫原的抗体的产生和gluc活性。[1372]根据本文所述的方法设计并纯化编码包括n端gluc信号序列的sars-cov-2rbd免疫原的第一环状rna(核酸seqidno:33；氨基酸seqidno:32)和编码gluc多肽的第二环状rna(核酸seqidno:37；氨基酸seqidno:36)。将第一环状rna和第二环状rna混合在一起以获得混合物。然后如实例16中所述用脂质纳米颗粒配制该混合物，以获得第一环状rna制剂。还如实例16中所述用脂质纳米颗粒单独配制第一环状rna和第二环状rna，然后混合在一起以获得第二环状rna制剂。[1373]三只小鼠在第0天肌内接种第一环状rna制剂(总剂量为10μgrbd+10μggluc)并且在第12天接种第二环状rna制剂(总剂量为10μgrbd+10μggluc)。在第0天和第12天还对另外的小鼠(每组3只或4只)进行以下肌内接种：(i)10μg剂量的用脂质纳米颗粒配制的第一环状rna；(ii)10μg剂量的用脂质纳米颗粒配制的第二环状rna；或(iii)pbs。[1374]通过下颌下抽吸从每只小鼠收集血液。用第一环状rna制剂初免后2天和17天将血液收集到干燥的无抗凝剂的试管中。通过在4℃下以1200g离心30分钟从全血中分离血清。通过酶联免疫吸附测定(elisa)，测定各血清样品中是否存在rbd特异性igg。将elisa板(maxisorp44240496孔，能肯公司)在4℃下用在100μl的1x包被缓冲液(百进生技公司(biolegend)，421701)中的sars-cov-2rbd(义翘神州生物技术有限公司，40592-v08b；100ng)包被过夜。然后用封闭缓冲液(含2％bsa和0.05％吐温20的tbs)将板封闭1小时。然后将血清稀释液(1:500、1:1500、1:4500和1:13,500)添加到每个孔的100μl封闭缓冲液中，并在室温下孵育1小时。用含洗涤剂的1xtris缓冲液(tbs-t)洗涤三次后，将板与抗小鼠igghrp检测抗体(艾博抗公司，ab97023)孵育1小时，接着用tbs-t洗涤三次，然后添加四甲基苯(百进生技公司，421101)。使elisa板反应10-20分钟，然后使用0.2n硫酸淬灭。在450nm下测定光密度(o.d.)值。[1375]将每个血清样品的光密度除以背景(包被有rbd，仅与二抗孵育的板)的光密度。绘制每个样品相对于背景的倍数。[1376]使用高斯荧光素酶活性测定法(赛默科技皮尔斯公司)测试gluc的活性。将50μl1xgluc底物添加到10μl血清中，以进行gluc荧光素酶活性测定。在发光检测仪(普洛麦格公司)中混合后立即读取平板。[1377]结果显示在初免后17天(即，注射第一环状rna制剂后17天)获得抗rbd抗体(图32a)，并且在初免后2天(即，注射第一环状rna制剂后2天)检测到gluc活性(图32b)。[1378]这些结果显示，包含两种编码不同免疫原的环状rna的环状rna制剂诱导免疫原特异性免疫反应。[1379]实验2[1380]在小鼠模型中评价配制于脂质纳米颗粒中的环状rna制剂的免疫原性，该环状rna制剂包含(a)编码sars-cov-2rbd免疫原的环状rna以及(b)编码流感血凝素(ha)免疫原的环状rna。还在小鼠模型中评价了针对sars-cov-2rbd和流感ha免疫原的抗体的产生。[1381]根据本文所述的方法设计并生产编码包括n端gluc信号序列的sars-cov-2rbd免疫原的第一环状rna(核酸seqidno:33；氨基酸seqidno:32)和编码来自甲型h1n1流感a/加利福利亚/07/2009的血凝素(ha)的第二环状rna(核酸seqidno:35；氨基酸seqidno:34)。将第一环状rna和第二环状rna混合在一起以获得混合物。然后如实例16中所述用脂质纳米颗粒配制该混合物，以获得第一环状rna制剂。还如实例16中所述用脂质纳米颗粒单独配制第一环状rna和第二环状rna，然后混合在一起以获得第二环状rna制剂。[1382]三只小鼠在第0天肌内接种第一环状rna制剂(总剂量为10μgrbd+10μgha)并且在第12天接种第二环状rna制剂(总剂量为10μgrbd+10μgha)。在第0天和第12天还对另外的小鼠(每组3只或4只)进行以下肌内接种：(i)10μg剂量的用脂质纳米颗粒配制的第一环状rna；(ii)10μg剂量的用脂质纳米颗粒配制的第二环状rna；或(iii)pbs。[1383]如实验1中所述采集血液。如实验1中所述，通过elisa确定rbd特异性igg的存在。[1384]通过elisa测定各血清样品中是否存在ha特异性igg。将elisa板在4℃下用ha重组蛋白(义翘神州生物技术有限公司，11085-v08b；100ng)包被过夜，并将板如实验1中所述进行处理。将每个血清样品的光密度除以背景(包被有ha，仅与二抗孵育的板)的光密度。绘制每个样品相对于背景的倍数。[1385]结果显示，在初免后17天(即，注射第一环状rna制剂后17天)获得抗rbd和抗ha抗体(图33a和图33b)。[1386]结果还显示，包含两种编码不同免疫原的环状rna的环状rna制剂在体内表达并诱导免疫原特异性免疫反应。[1387]实验3[1388]在小鼠模型中评价配制于脂质纳米颗粒中的环状rna制剂的免疫原性，该环状rna制剂包含(a)编码sars-cov-2刺突免疫原的环状rna以及(b)编码流感血凝素(ha)免疫原的环状rna。还在小鼠模型中评价了针对sars-cov-2刺突和流感ha免疫原的抗体的产生。[1389]根据本文所述的方法设计并生产编码sars-cov-2刺突免疫原的第一环状rna(核酸seqidno:31；氨基酸seqidno:30)和编码来自甲型h1n1流感a/加利福利亚/07/2009的血凝素(ha)的第二环状rna(核酸seqidno:35；氨基酸seqidno:34)。将第一环状rna和第二环状rna混合在一起以获得混合物。然后如实例16中所述用脂质纳米颗粒配制该混合物，以获得第一环状rna制剂。还如实例16中所述用脂质纳米颗粒单独配制第一环状rna和第二环状rna，然后混合在一起以获得第二环状rna制剂。[1390]三只小鼠在第0天肌内接种第一环状rna制剂(总剂量为10μg刺突+10μgha)并且在第12天接种第二环状rna制剂(总剂量为10μg刺突+10μgha)。在第0天和第12天还对另外的小鼠(每组3只或4只)进行以下肌内接种：(i)10μg剂量的用脂质纳米颗粒配制的第一环状rna；(ii)10μg剂量的用脂质纳米颗粒配制的第二环状rna；或(iii)pbs。[1391]如实验1中所述采集血液。通过在4℃下以1200g离心30分钟从全血中分离血清。如实验1中所述，通过elisa测定各血清样品中是否存在rbd(即刺突的rbd)特异性igg。[1392]通过elisa测定各血清样品中是否存在ha特异性igg。将elisa板在4℃下用ha重组蛋白(义翘神州生物技术有限公司，11085-v08b；100ng)包被过夜，并将板如实验1中所述进行处理。将每个血清样品的光密度除以背景(包被有ha，仅与二抗孵育的板)的光密度。绘制每个样品相对于背景的倍数。[1393]结果显示，在初免后17天(即，注射第一环状rna制剂后17天)获得抗rbd抗体和抗ha抗体(图34a和图34b)。[1394]结果还显示，包含两种编码不同免疫原的环状rna的环状rna制剂在小鼠中诱导免疫原特异性免疫反应。[1395]实例49：包含多种免疫原的环状rna在小鼠模型中的免疫原性[1396]该实例描述了包含多种免疫原的环状rna的免疫原性。该实例还描述了在小鼠模型中针对由单个环状rna编码的多种免疫原的抗体的产生。[1397]实验1[1398]该实例描述了包含多种免疫原的环状rna的免疫原性。该实例还描述了在小鼠模型中针对由单个环状rna编码的多种免疫原的抗体的产生。[1399]在该实例中，将第一环状rna设计成包括ires，其后是编码gluc多肽的orf、终止密码子、间隔子、ires、编码sars-cov-2rbd免疫原的orf和终止密码子，如实例47中所述产生和纯化。还如上所述产生以下环状rna：(i)具有ires和编码gluc多肽的orf的第二环状rna；和(ii)具有ires和编码sars-cov-2rbd免疫原的orf的第三环状rna。[1400]如实例16所述，将第一环状rna和第二环状rna各自与脂质纳米颗粒一起配制以分别获得第一环状rna制剂和第二环状rna制剂。还用脂质纳米颗粒单独配制第二环状rna和第三环状rna，然后混合在一起以获得第三环状rna制剂。[1401]在第0天和第28天对每组三只小鼠进行以下肌内接种：(i)第一环状rna制剂(每次注射40μg剂量)；或(ii)第二环状rna制剂(每次注射10μg剂量)；或(iii)第三环状rna制剂(每次注射10μggluc+10μgrbd剂量)。[1402]通过下颌下抽吸从每只小鼠收集血液。在环状rna初免后第2、14、28、35、43、49、61、62和63天，将每只小鼠的血液收集到干燥的无抗凝剂的管中。通过在4℃下以1200g离心30分钟从全血中分离血清。通过酶联免疫吸附测定(elisa)，测定各血清样品中是否存在rbd特异性igg。将elisa板(maxisorp44240496孔，能肯公司)在4℃下用在100μl的1x包被缓冲液(百进生技公司(biolegend)，421701)中的sars-cov-2rbd(义翘神州生物技术有限公司，40592-v08b；100ng)包被过夜。然后用封闭缓冲液(含2％bsa和0.05％吐温20的tbs)将板封闭1小时。将血清连续稀释(4倍，8次：1:500至1:8192000)，然后添加到每个孔中的100μl封闭缓冲液中，并在室温下孵育1小时。用含洗涤剂的1xtris缓冲盐水(tbs-t)洗涤三次后，将板与抗小鼠igghrp检测抗体(艾博抗公司，ab97023)孵育1小时，接着用tbs-t洗涤三次，然后添加tmbelisa底物(皮尔斯公司，34021)。使elisa板反应10-20分钟，然后使用2n硫酸终止。在450nm下测定光密度(o.d.)值。血清滴度定义为给出高于背景5倍的o.d.值的最高血清稀释度的倒数。[1403]使用高斯荧光素酶活性测定法(赛默科技公司，16159)测试gluc的活性。将50μl1xgluc底物添加到10μl血清中，以进行gluc荧光素酶活性测定。在发光检测仪(普洛麦格公司)中混合后立即读取平板。[1404]结果显示在初免后2天(即，注射第一、第二或第三环状rna制剂后2天)检测到gluc活性(图36)，并且在初免后14天(即，注射第一、第二或第三环状rna制剂后14天)获得抗rbd抗体(图37a)。在环状rna初免后28、35、43、49、61、62和63天也获得抗rbd抗体(数据未显示)。[1405]在给药后第63天，使用测量相对igg1与igg2a同种型的测定法来表征血清抗体，并且使用噬斑减少中和试验测定法来表征血清抗体中和病毒的能力。结果显示在第一环状rna制剂和第三环状rna制剂给药的小鼠中获得了中和抗体(图37b)。[1406]这些结果显示编码两种免疫原的单个环状rna可引发免疫原特异性免疫反应。另外，结果显示包含编码sars-cov-2rbd免疫原的orf的环状rna具有中和能力。[1407]实验2[1408]在小鼠模型中评价包含配制在脂质纳米颗粒中的环状rna的环状rna制剂的免疫原性，该环状rna设计为包括ires，其后是编码sars-cov-2rbd免疫原的orf、终止密码子、间隔子、ires、编码mersrbd免疫原的orf和终止密码子。还在小鼠模型中评价了针对sars-cov-2rbd和mersrbd免疫原的抗体的产生。[1409]然后如实例16中所述用脂质纳米颗粒配制该环状rna，以获得环状rna制剂。[1410]在第0天和初始施用后至少一天，以5μg、10μg、20μg或50μg的量用环状rna制剂对小鼠进行肌内或皮内接种。[1411]如实验1中所述采集血液。如实验1中所述，通过elisa确定sars-cov-2rbd特异性和mersrbd特异性igg的存在。[1412]测定各血清样品中是否存在抗sars-cov-2rbd结合抗体、抗mersrbd结合抗体、针对sars-cov-2rbd免疫原的中和抗体、针对mersrbd免疫原的中和抗体、对sars-cov-2免疫原的细胞反应以及对mersrbd免疫原的细胞反应。[1413]实例50：对t细胞反应的评价[1414]实验1[1415]使用elispot测定法检测sars-cov-2刺突或rbd特异性t细胞或流感ha特异性t细胞的存在。对来自实例48的以下几组小鼠进行该项测定：[1416]1.rbd[1417]2.gluc[1418]3.ha[1419]4.刺突[1420]5.rbd+ha[1421]6.刺突+ha[1422]7.pbs[1423]在加强后第30天(即，注射第一环状rna制剂后30天)收获小鼠脾脏，并将其加工成单细胞悬液。将脾细胞以每孔0.5m细胞接种在ifn-γ或il-4elispot板(immunospot)上。脾细胞不受刺激或用sarscov-2和ha肽库(jpt、pm-wcpv-srb和pm-ifna_hacal)刺激。将elispot板根据制造商的方案进行处理。[1424]实验2[1425]使用elispot测定法检测sars-cov-2rbd特异性t细胞的存在。对来自实例49的几组小鼠进行该项测定。[1426]在初免后第63天(即，注射第一、第二或第三环状rna制剂后63天)收获小鼠脾脏，并将其加工成单细胞悬液。将脾细胞以每孔0.5m细胞接种在ifn-γ(迈博太科(mabtech))上。脾细胞不受刺激或用sarscov-2rbd肽库(jpt，pm-wcpv-srbd)刺激。将elispot板根据制造商的方案进行处理。[1427]结果显示包含编码不同的两种免疫原的单一环状rna的环状rna制剂诱导免疫原特异性t细胞反应(图38)。[1428]实例51：施用了编码多种免疫原的环状rna的小鼠中的抗体反应的评价[1429]本实例证明由编码多种免疫原表达的环状rna的施用产生抗体反应。[1430]使用血凝抑制测定法(hai)测量来自小鼠的血清中妨碍血凝的抗流感ha抗体。向小鼠施用环状rna的制剂，每种环状rna根据本文所述的方法设计和产生，并且编码以下物质的表达：sars-cov-2rbd免疫原、sars-cov-2刺突免疫原、流感ha免疫原、sars-cov-2rbd免疫原和流感ha免疫原、sars-cov-2rbd免疫原和gluc多肽，或sars-cov-2rbd免疫原和sars-cov-2刺突免疫原。血液采集如实例47实验1所述，并在注射后第2天和第17天进行。[1431]制备在第2天和第17天从小鼠收集的样品的两倍连续稀释液。将固定量的具有已知血凝素(ha)滴度的流感病毒添加到96孔板的每个孔中，达到相当于4个血凝素单位的浓度，血清对照孔除外，其中不添加病毒。将板在室温下静置60分钟，之后添加红细胞样品并使其在4℃下孵育30分钟。妨碍血凝的最高血清稀释度经确定为血清的hai滴度。第17天收集的样品显示，当单独施用或与sars-cov-2免疫原例如rbd或刺突组合施用时，施用了编码流感ha免疫原的环状rna制剂的样品中出现hai滴度(图35)。在未施用ha免疫原(例如单独的sars-cov-2rbd免疫原或单独的sars-cov-2刺突免疫原)的样品中，在第17天未见hai滴度。[1432]实例52：哺乳动物细胞中由环状rna表达佐剂[1433]该实例证明哺乳动物细胞中由环状rna表达多肽佐剂。[1434]在该实例中，将环状rna设计成包括ires、编码佐剂il-12的orf(核酸seqidno:38；氨基酸seqidno:39)和侧接ires-orf的两个间隔元件。作为对照，使用包括ires、编码sars-cov-2rbd免疫原的orf和侧接ires-orf的两个间隔元件的环状rna。根据本文所述的方法产生并纯化环状rna。[1435]使用lipofectaminemessengermax(英杰公司lmrna001)根据制造商的说明将纯化的环状rna(0.1皮摩尔和1皮摩尔)转染到hela细胞(10,000个细胞/孔)中。[1436]在细胞培养上清液中使用il-12特异性elisa(赛默飞世尔公司，bms6004)测量il-12表达。数据示为两次重复的平均值和sem值。[1437]结果显示由环状rna编码的il-12由hela细胞表达而在对照中不表达(图39)。本实例显示il-12佐剂在哺乳动物细胞中由环状rna表达。[1438]实例53：在小鼠模型中由环状rna体内表达佐剂[1439]本实例证明由环状rna体内表达多肽佐剂。[1440]在该实例中，根据本文所述的方法产生并纯化以下环状rna：(i)具有ires和编码il-12佐剂的orf的第一环状rna(核酸seqidno:38；氨基酸seqidno:39)；和(ii)具有ires和编码具有n端gluc信号序列的sars-cov-2rbd免疫原的orf的第二环状rna(核酸seqidno:33；氨基酸seqidno:32)。还如实例16中所述用脂质纳米颗粒各自单独配制第一环状rna和第二环状rna，然后混合在一起以获得第一环状rna制剂。[1441]三只小鼠在第0天肌内接种第一环状rna制剂(10μg剂量)。作为对照，对每组三只小鼠进行以下肌内接种：(i)用脂质纳米颗粒(10μg剂量)配制的第二环状rna(即第二环状rna制剂)；或(ii)pbs。通过下颌下抽吸从每只小鼠收集血液。在施用环状rna或pbs后2天，将每只小鼠的血液收集到干燥的无抗凝剂的管中。通过在4℃下以1200g离心30分钟从全血中分离血清。使用细胞因子珠粒阵列(百进生技公司，749622)测定各个血清样品中il12的存在。数据示为三次重复的平均值和sem值。[1442]结果显示，在注射第一环状rna制剂后2天在血清中检测到il-12表达，但在注射任一对照后未检测到(图40a)。[1443]为了确定表达的il12是否是功能性的，在注射环状rna制剂后2天测量血清中的ifn-γ(直接在il12信号传导的下游)产生。在本文所述的相同细胞因子珠粒阵列测定(百进生技公司，749622)中在血清中检测到ifn-γ产生。数据示为3次重复的平均值和sem值。[1444]结果显示血清ifn-γ增加，表明环状rna表达的il12是功能性的(图40b)。[1445]实例54：通过共同施用由多个环状rna编码的免疫原和佐剂在小鼠模型中诱导免疫原性[1446]本实例证明了通过向受试者施用多个环状rna诱导的免疫原性。施用的一种环状rna编码免疫原。施用的另一种环状rna编码多肽佐剂。[1447]在该实例中，根据本文所述的方法产生并纯化以下环状rna：(i)具有ires和编码il-12佐剂的orf的第一环状rna(核酸seqidno:38；氨基酸seqidno:39)；和(ii)具有ires和编码具有n端gluc信号序列的sars-cov-2rbd免疫原的orf的第二环状rna(核酸seqidno:33；氨基酸seqidno:32)。还如实例16中所述用脂质纳米颗粒各自单独配制第一环状rna和第二环状rna，然后混合在一起以获得第一环状rna制剂。[1448]三只小鼠在第0天和第14天肌内接种第一环状rna制剂(每次注射每种环状rna为2.5μg剂量)。作为对照，对每组三只小鼠进行以下肌内接种：(i)用脂质纳米颗粒(每次注射2.5μg剂量)配制的第二环状rna(即第二环状rna制剂)；或(ii)pbs。第一剂量后22天将小鼠安乐死，并将脾细胞加工成单细胞悬浮液。脾细胞不受刺激或用rbd肽库(jpt，pm-wcpv-s-rbd-2)刺激1小时。然后将蛋白转运抑制剂(莫能菌素(monensin)，bd554724)和布雷菲德菌素(brefeldin)a，bd555029)添加到培养基中，接着再培养5小时。使用bd固定和透化试剂盒(bd，554714)根据制造商的方案将细胞染色。使用的抗体：活性染料(赛默飞世尔公司，l1011)、cd8(赛默飞世尔公司，ma5-16759)和cd44(百进生技公司，103026)。通过流式细胞术分析染色的细胞。[1449]数据显示，相对于对照，即第二环状rna制剂，第一环状rna制剂增加了rbd特异性cd4t细胞的数目(图41a)，并且没有观察到rbd特异性cd8t细胞的变化(图41b)。另外，第一环状rna制剂增加cd4和cd8t细胞产生的ifn-γ的量(图41c、图41d)。这显示表达il12的环状rna充当佐剂加强由表达免疫原的环状rna引发的细胞免疫反应。数据示为3次重复的平均值和sem。图41a：星号表示通过双因素rmanova保护的tukey事后检验测定的统计学显著性。图41c、图41d：星号表示通过非配对t检验测定的统计学显著性。[1450]实例55：共同施用由多种环状rna编码的免疫原和佐剂后的t细胞反应的评价[1451]在该实验中，根据本文所述的方法产生并纯化以下环状rna：(i)第一环状rna，其包括ires、编码卵白蛋白(ova)的orf(核酸seqidno:40；氨基酸seqidno:41)，和侧接ires-orf的两个间隔元件；和(ii)第二环状rna，其包括ires、编码佐剂il-12的orf(核酸seqidno:38；氨基酸seqidno:39)，和侧接ires-orf的两个间隔元件。将第一环状rna和第二环状rna混合在一起并且与lipofectaminemessengermax(英杰公司lmrna001)复合以获得混合物。作为对照，还产生了包括ires、编码gluc多肽的orf和侧接ires-orf的两个间隔元件的第三环状rna。[1452]使用lipofectaminemessengermax根据制造商的说明将以下物质转染到el4细胞中(每孔10,000个细胞；从atcc获得el4细胞)：[1453]1)与lipofectaminemessengermax复合的第一环状rna和第二环状rna的混合物(0.1皮摩尔ernaova+0.1皮摩尔ernail12)；[1454]2)第一环状rna(0.1皮摩尔，ernaova)；[1455]3)第二环状rna(0.1皮摩尔，ernail12)；[1456]4)第三环状rna(0.1皮摩尔，ernagluc)；[1457]5)单独的转染试剂(空白转染)。[1458]将经过转染的el4细胞与ot-icd8t细胞(ova特异性t细胞；分离自来自杰克逊实验室的ot-i小鼠)共同培养2天。通过ifn-γ的产生情况来监测t细胞的活化状态。2天后收获上清液并使用细胞因子珠粒阵列(百进生技公司，741044)检测ifn-γ。数据示为3次重复的平均值和sem。星号表示通过单因素anova保护的tukey事后检验测定的统计学显著性。[1459]图42显示当与对照(仅表达ova的环状rna)相比时，表达ova的环状rna与表达il12的环状rna组合诱导更强的cd8t细胞反应。这证明表达il12的环状rna充当佐剂。[1460]实例中援引的序列[1461]seqidno：1[1462][1463]seqidno：2[1464][1465]seqidno：3[1466][1467][1468]seqidno：4[1469][1470]seqidno：30[1471][1472]seqidno：31[1473][1474][1475]seqidno：32[1476][1477]seqidno：33[1478][1479][1480]seqidno：34[1481][1482]seqidno：35[1483][1484]seqidno：36[1485][1486]seqidno：37[1487][1488]seqidno：38[1489][1490]seqidno：39[1491][1492][1493]seqidno：40[1494][1495]seqidno：41[1496]当前第1页12当前第1页12